对根据 本发明提供的aSyn聚集物）的反应性可以通过称为解蔽（demasking)(从自身抗体移除 潜在结合的aSyn抗原）的步骤而增加。这与来自健康受试者的aSyn特异性免疫球蛋白 的反应性相反，其中在使用特殊的方法处理这些血清后，无法检测到针对aSyn聚集物的 反应性的增加。另一方面，解蔽（血清中已经结合的aSyn的解离）后IgM抗体的反应性 显示和MSA患者中IgM水平的增加。另外，也确定了解蔽和不解蔽的IgG水平之间的差 异（delta(A)值）。与健康对照相比，这一参数在TO和MSA患者中也升高，表明在所述疾 病的病理状态中，抗体较高的aSyn抗体占有率。此外，本发明提供的数据表明与迄今为止 发表的方法相比，本方法具有高得多的检测aSyn特异性抗体能力，并因此具有高得多的 能力以诊断例如ro和MSA。考虑到这些事实，本发明的方法符合鉴定突触核蛋白病，特别是 ro和MSA，以及跟踪给定患者对治疗的临床反应的预测性诊断工具的理论先决条件。
[0031] 开发本发明用于在人样品中分析aSyn特异性抗体。因此，优选的实施方案检测 人aSyn特异性抗体，优选人IgG或IgM抗体，特别是人IgG抗体。正如已经提及的，在人 中对aSyn特异性抗体的检测的原理是本领域已知的；然而，作为一种可能的生物标志物 的作用无法验证。如本发明所示，这是由于本领域中可用的检测方法的分析功能不足。由 于本发明方法的优越性，使得人样品中这些抗体作为生物标志物是可用的。因此，本方法特 别适合检测生物样品中的自身抗体。因此，在本方法的优选实施方案中，待检测和定量的 aSyn特异性抗体是自身抗体。
[0032]与现有技术的方法形成对比，本发明使用aSyn聚集物作为探针用于结合来自于 样品的aSyn特异性抗体。虽然这种聚集物的原理在本领域中是已知的，但是没有意识到 这种聚集物在特别是人样品中aSyn特异性抗体的分析中的使用，可以显著改进这些方 法，其也与单颗粒检测技术，例如FACS联合。由于这种聚集物的使用，使用单颗粒检测技术 (其为多个不同领域中建立的技术并用于不同问题）的检测可能用于分析通常非常复杂和 难以处理的人样品（例如血液）中的aSyn特异性抗体。
[0033]优选地，根据本发明待使用的聚集物的尺寸经过标准化用于分析用途。这可以通 过在聚集物的产生期间，建立特定的参数来完成。根据聚集物产生期间应用的条件，可以调 节所述聚集物的尺寸。根据本发明的aSyn聚集物的优选尺寸为从50nm至15μm，优选从 100nm至10μπι，特别优选从500nm至5μηι(通过所述聚集物的长度确定（例如最长范围））。
[0034]提供适合用于本发明的聚集物的优选方法包含将全长aSyn(l-140)，自然存在的 剪接变体包括aSyn-98,aSyn-112和aSyn-126或修饰的全长aSyn包括磷酸化的（特 别是在丝氨酸129-Serl29)，亚硝基化的/硝化的，乙酰化的和单，二，或三泛素化的aSyn， 或C端截短形式的aSyn例如缺少C端20-30个氨基酸或甚至更短的aSyn蛋白，其能够 形成聚集物，在pH2至9孵育至少20分钟，优选1小时，特别是至少4小时的步骤。孵育 的持续时间是调整所述聚集物尺寸的一个参数：孵育的时间越长，聚集物越大。典型的孵育 时间从10分钟至24小时，较短的孵育时间通常导致仅非常小的聚集物和少量的聚集物；在 本发明法中通常不优选比48小时显著更长的孵育时间产生的聚集物。当然，如果需要，也 可以分选和"筛分（sieved) "聚集物来达到所需的尺寸，例如，通过分级离心和类似的技术。
[0035] 根据本发明的包含aSyn的聚集物的优选实施方案涉及除了aSyn或aSyn多肽 之外，含有Αβ或其变体的聚集物。对于aSyn，仅使用允许聚集物形成的变体。因此，在包 含aSyn的聚集物中，优选下组的Αβ变体（最优选组4,接着组3,接着组2和组1)。
[0036]Αβ变体组1 :含有核心序列Αβ16-20或第二核心序列Αβ25-35的肽。已经表明 这些肽自身形成淀粉样纤丝。从这些核心序列起始，可以通过Αβ肽中存在的氨基酸或通 过形成截短的天然Αβ肽或截短的修饰Αβ肽的替换氨基酸延伸肽。
[0037]Αβ变体组 2:含有序列Αβ16-20-Χ21 23-24-28-Χ29 3。-31-36 的肽（表示存在aa16 至20, 24至28和31至36并通过3个或2个aa连接物连接（任意的一级序列））。从这 一序列起始，可以通过Αβ肽中存在的氨基酸或通过形成截短的天然Αβ肽或截短的修饰 Αβ肽的替换氨基酸延伸肽。
[0038]Αβ变体组3:含有序列Αβ16-36的肽。从这一序列起始，可以通过Αβ肽中存在 的氨基酸或通过形成截短的天然Αβ肽或截短的修饰Αβ肽的替换氨基酸延伸肽。
[0039]Αβ变体组4:含有序列Αβ11-36或Αβρ(Ε) 11-36的肽。从这一序列起始，可以 通过Αβ肽中存在的氨基酸或通过形成截短的天然Αβ肽或截短的修饰Αβ肽的替换氨基 酸延伸肽。
[0040] 根据本发明的包含aSyn的聚集物的另一个优选实施方案涉及聚集物，其除了 aSyn或aSyn多肽以外，含有Tau蛋白或其变体。对于aSyn(和Αβ)，仅使用允许聚集 物形成的变体。最优选的是Tau的聚集物，然而，其它的包含aSyn的聚集物可以包含具有 修饰或截短形式的Tau(例如，Tau441加上过度磷酸化的Tau441和/或较短版本的Tau(例 如，Tau412,410, 383, 381，352)，特别是那些在健康个体的中自然存在的或特别是对于疾病 具有标志物功能的Tau蛋白（所有6种自然存在的同种型的任一种同种型或其变体形式 (例如P301L，P301S，V337M等），例如，优选在氨基酸 181，202, 205, 212, 214, 231，396 以及 任选在Tau中存在的另外的残基像是18, 153, 175, 199, 235, 262, 394, 404和422同时磷酸 化的）。
[0041] 根据本发明的包含aSyn的聚集物的另一个优选实施方案涉及聚集物，其除了 aSyn或aSyn多肽以外，含有胰岛淀粉样多肽（IAPP)或其变体。IAPP作为89个氨基酸 的前激素原合成。信号肽的剪切导致含有67个氨基酸的pro-IAPP。后者进一步处理为37 个残基的成熟IAPP。已经表明pro-IAPP的正常处理是两步的过程，通过在其C00H端剪切 起始（可能是通过反式高尔基体网络中的激素原转化酶1/3)，接着在其NH2端剪切（通过 颗粒中的激素原转化酶2)以形成成熟形式的IAPP。在哺乳动物物种之间，IAPP高度保守， 但在氨基酸20和29之间展现出显著的变异。该区域的差异决定IAPP聚集并形成淀粉样 蛋白的能力。实际上，在该区域具有一个或多个脯氨酸残基的种类（除了猫之外）不形成 胰岛淀粉样蛋白。IAPP通过其在胰岛淀粉样蛋白沉积物中聚集发现，所述沉积物与2型糖 尿病患者（2型糖尿病；T2D)和其它哺乳动物物种像是猴和猫中的β细胞功能障碍和死亡 相关。淀粉样蛋白是具有折叠片结构的不可溶的、纤丝状的蛋白聚集物。淀粉样蛋白 当使用Congo红或硫磺素S染色后具有典型的光学特性，并可以通过光学显微镜分析。然 而，淀粉样蛋白的形成开始于纤丝或聚集物的形成（直径7-10nm而长度几百nm)，在通过 光学显微镜观察到淀粉样蛋白迹象前，其可以通过电子显微镜检测。在T2D患者中，对胰腺 组织的组织学分析表明，IAPP聚集物的累积导致β细胞团替换，导致进行性的β细胞功 能障碍和高血糖症。除此之外，ΙΑΡΡ纤丝似乎对胰岛具有直接的损伤作用。在多于95%的 II型糖尿病患者中发现胰腺淀粉样蛋白沉积物，并且其形成与疾病进展密切相关。通常来 说，淀粉样蛋白可以从蛋白形成，所述蛋白以其非聚集状态折叠为紧凑的三级结构，或者其 可以源自内源性无序多肽，所述多肽无法以其可溶的天然状态采取紧凑的三级结构。ΙΑΡΡ 是一种内源性无序多肽的重要例子，其在体内形成淀粉样蛋白。虽然ΙΑΡΡ是T2D患者胰腺 中的胰岛淀粉样蛋白的主要成分，在这些沉积物中已鉴定了至少两种另外的成分：ap〇E和 硫酸乙酰肝素蛋白多糖素（HSPGs)。淀粉样蛋白形成的动力学复杂并表现出S型概况，其特 征为最终稳定的状态，其中可溶形式的肽与淀粉样蛋白纤丝达到平衡。可以通过在称为"播 种"的过程中添加少量的预制纤丝加速淀粉样蛋白的形成。在T2D中分泌的一部分IAPP是 未完全处理的。对pro-IAPP的順2端处理的损害导致淀粉样蛋白形成和β细胞死亡。NH2 端延伸的人pro-IAPP中间物（IAPP-Npro)的积累可能是淀粉样蛋白形成的重要起始步骤。 实际上，虽然发现IAPP-Npro在溶液中比成熟的IAPP较少产生淀粉样蛋白，其与HSPGs的 一种组分，葡糖氨基葡聚糖（GAGs)更有效地相互作用。因此，具有损害的順2端处理的IAPP 形式，特别是IAPP-Npro,是根据本发明的包含aSyn的聚集物中优选的形式。
[0042] 根据本发明的包含aSyn的聚集物的另一个优选实施方案涉及聚集物，其除了 aSyn或aSyn多肽以外，含有除了aSyn或aSyn多肽以外的至少两种其它的聚集物组 分，特别是一种或多种Αβ或其变体和/或一种或多种Tau蛋白或其变体和/或一种或多 种IAPP或其变体。
[0043] 根据本发明的包含aSyn的聚集物的另一个优选实施方案涉及聚集物，其除了本 文公开的aSyn或aSyn多肽以外，含有不同的聚集物形成多肽种类的聚集组分（如本文 所使用的，术语"多肽"包括术语"蛋白"并且通常这两个术语同义地使用；因此术语"蛋白" 应用于本文也用于具有少于1〇〇个或少于50个氨基酸残基的多肽）。优选地，这种其它的 聚集物形成多肽种类选自下组：Tau蛋白或其聚集物形成变体，Αβ1-42肽或其聚集物形成 变体；IAPP和其聚集物形成变体，特别是IAPP-Npro,TAR-DNA结合蛋白43 (TDP43)或其聚 集物形成变体；以及超氧化物歧化酶1(S0D1)或其聚集物形成变体形式。
[0044] 如已经陈述的，Tau的优选聚集物形成变体（"Tau变体"）是过度磷酸化的Tau， 异常磷酸化的Tau(如Shahani等，J.Neurosci. 26 (2006)，6103-6114中所述并定义的），具 有疾病标志物功能的Tau蛋白变体（所有6中自然存在的同种型的任一同种型（Tau441，T au412,Tau410,Tau383,Tau38l,Tau352)或其突变形式（例如P3〇lL,P3〇lS,V337M等）例 如，优选地在氨基酸181，202, 205, 212, 214, 231，396以及任选在Tau中存在的另外残基像 是 18, 153, 175, 199, 235, 262, 394, 404 和 422 同时磷酸化的Tau441,Tau412,Tau410,Tau383 ,Tau381,Tau352(对Tau磷酸化更详细的分析公开于例如，Hangeretal·,TrendsinMol. Med. 15(2009)，112-119 中）。
[0045] 根据本方法，其中aSyn特异性抗体待检测的样品与aSyn聚集物接触，以完成与 所述样品中可能存在的aSyn特异性抗体的结合（以及相对aSyn聚集物反应）。因此，为 了提供足够的抗体结合位置，必须调节aSyn聚集物的浓度。因此，用于结合所述样品中的 抗体的aSyn聚集物的浓度优选在0. 01至10μΜ的范围内，优选0. 1至1μM。最优浓度也 取决于待结合的抗体的特性，所述样品的特性，计划的接触时间和所述聚集物的尺寸。
[0046] 本方法主要目标为应用于人样品。因此优选的生物样品是人血液或源自人血液的 样品，优选人血清或人血浆；人脑脊液或淋巴液。使用这些样品来源，也可以建立系列和常 规检测（特别是对于源自血液的样品）。
[0047] 允述样品中的抗体与所述聚集物适当结合的优选接触时间为至少10分钟（例如 10分钟至48小时），优选从15分钟至24小时，特别是从30分钟至2小时。
[0048] 如果所述生物样品没有特别的预处理，具有与aSyn聚集物结合能力的aSyn特 异性抗体将在与aSyn聚集物接触期间结合。通过根据本发明的方法，在所述样品中被掩 蔽的aSyn特异性抗体（例如，那些已经结合了结合伴侣（例如包含aSyn的结构，或内源 性aSyn肽）的抗体）将不被检测到（没有这些特定样品的前处理）。然而。仅对反应性 抗体的鉴定和定量在很多情况下将是足够的和所需的，也许存在这样的情况或诊断问题， 其中应当检测aSyn特异性抗体的总量（反应的和不反应的），或者应当检测以下所有项： 反应性aSyn特异性抗体，不反应的aSyn特异性抗体（"掩蔽的"）以及aSyn特异性抗 体总数。
[0049] 因此，根据本发明的另一个优选实施方案，所述样品被解蔽，例如，在与根据本发 明的aSyn聚集物接触之前，aSyn特异性抗体从与样品中存在的任意结合伴侣的结合"释 放"。这允许检测样品中所有的a