球，质控微球为标记有鸡IgY或兔IgG的质控微球。所述检测微球和质控微球均为表面带有羟基或氨基的娃胶微球或聚苯乙稀微球。并且，检测微球和质控微球的粒径均为50?500nm。
[0032]所述硝酸纤维素膜4上的检测线6和标记垫3上采用的O型口蹄疫抗原均为灭活O型口蹄疫病毒抗原、O型口蹄疫疫苗或O型口蹄疫结构蛋白VPl、VP2和VP3的重组蛋白。
[0033]所述样品垫2为检测血清或血浆的样品垫，或者为检测全血的样品垫。检测全血的样品垫可以为滤血膜或加入有抗猪RBC的样品垫。
[0034]所述猪血样品中O型口蹄疫病毒抗体、O型口蹄疫病毒抗原的标记物和硝酸纤维素膜上包被O型口蹄疫病毒抗原是通过双抗原夹心法来检测猪血样本中O型口蹄疫病毒抗体。
[0035]标记垫3上喷的镧系荧光微球，其镧系荧光是指镧系元素与β—二酮配基产生的荧光，标记在生物原料上的镧系荧光微球的镧系荧光物质是指镧系元素Eu、Sm和Tb与β—二酮配基产生的荧光。采用检测仪检测镧系元素与配合物的独特荧光光谱特性。
[0036]制备存储有O型口蹄疫病毒抗体检测标准曲线的IC卡:配置含有O型口蹄疫病毒抗体的校准液(含O型口蹄疫病毒抗体标准品)6份，浓度分别为0、1/1024、1/256、1/64、1/16、1/4(0型口蹄疫病毒抗体标准品倍比稀释)。将上述不同浓度的校准液分别加入装配好的检测卡的加样孔内，层析15分钟后，通过检测仪进行检测，将6次得到的检测结果线性回归得到标准曲线，参见图4，最后将此曲线数据存入IC卡中。每一批检测卡需要对应配置一个IC卡。
[0037]该检测卡的使用方法:将待检样品(以血浆为例)与样品稀释液按1:40比例稀释，将稀释好的样本80ul加入加样孔11中，在吸水纸5的作用下，样本从样品垫2向吸水纸5方向移动。在避免强光照射的情况下层析15min，然后用检测仪对检测卡进行检测，检测仪获取检测线6和质控线7的荧光信号，并与此批检测卡的IC卡中储存的标准曲线进行对比，通过标准曲线计算出待检样本的浓度，参见图4的标准曲线。
[0038]上述检测卡的制备方法如下:
[0039]步骤一，把硝酸纤维素膜粘贴在PVC底板上，采用点膜喷金专用机器在硝酸纤维素膜上喷涂已稀释至0.5mg/ml的羊抗鸡IgY的IgG形成质控线和已稀释至1.0mg/ml的O型口蹄疫灭活病毒形成检测线，喷量为Ιμ?/cm，然后在37°C的温度下烘制8小时；
[0040]步骤二，用封闭液(该封闭液的组成为5g/L的BSA(牛血清白蛋白)、质量浓度1%的PVA(聚乙烯醇)，pH7.5的1mM的磷酸盐缓冲液)封闭硝酸纤维素膜30分钟，用1mM磷酸缓冲液清洗硝酸纤维素膜30分钟，干燥2小时后备用；
[0041 ]步骤三，制备标记有鸡IgY的镧系荧光微球和标记有O型口蹄疫结构蛋白VPl重组抗原的镧系荧光微球，将ImL的镧系荧光微球加入到50mg的MES( 2-( N-吗啡啉)乙磺酸)缓冲液(0.1Μ，ρΗ7.0)中，再加入1mg碳二亚胺(EDC)和1mg N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐搅拌溶解，室温反应30分钟后进行离心操作，将离心沉淀物用50mM硼酸缓冲液(pH8.2)复溶，加入2mg透析过的鸡lgY，在室温条件下搅拌反应24小时，然后离心、封闭后，再在稀释液中保存(保存环境温度为2?8°C)，即得标记有鸡IgY的镧系荧光微球;采用上述同样的方法标记O型口蹄疫结构蛋白VPl重组抗原的镧系荧光微球；
[0042]步骤四，把标记有鸡IgY和标记有O型口蹄疫结构蛋白VPl重组抗原的镧系荧光微球并分别稀释至浓度0.lyg/ml和3yg/ml，采用点膜喷金机器将其喷涂在载体基层上构成标记垫，喷量为2.5 μ I/cm，然后在37°C的温度下烘制8小时；
[0043]步骤五，把样品垫、标记垫、吸水纸依次粘在PVC底板上，组装成大卡，再用剪切机切割成5_宽的试纸条，装配在检测卡外壳内，即得到本O型口蹄疫病毒抗体检测卡。
[0044]以上所述仅为本实用新型的较佳实施例而已，并不用以限制本实用新型，凡在本实用新型的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本实用新型的保护范围之内。
【主权项】
1.一种O型口蹄疫病毒抗体检测卡，包括装配在外壳内的检测卡本体，其特征在于:所述检测卡本体包括底板，在底板上依次设置样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述标记垫由载体基层和标记物组成，标记物为载体基层上喷涂镧系荧光检测微球和镧系荧光质控微球形成的一层膜，所述检测微球和质控微球均为表面带有羟基或氨基的硅胶微球或聚苯乙稀微球，且检测微球和质控微球的粒径均为50?500nm，所述硝酸纤维素膜上包被O型口蹄疫抗原为检测线，包被羊抗鸡抗体为质控线，在外壳上对应样品垫开设加样孔，对应硝酸纤维素膜上的检测线和质控线开设视窗孔。2.根据权利要求1所述的O型口蹄疫病毒抗体检测卡，其特征在于:所述底板为PVC底板，在PVC底板上从左至右依次粘贴样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，且样品垫的右端搭在标记垫的左端上，标记垫的右端搭在硝酸纤维素膜的左端上，吸水纸左端搭在硝酸纤维素膜的右端上。3.根据权利要求1所述的O型口蹄疫病毒抗体检测卡，其特征在于:所述检测微球为标记有O型口蹄疫抗原的微球，质控微球为标记有鸡IgY或兔IgG的质控微球。4.根据权利要求3所述的O型口蹄疫病毒抗体检测卡，其特征在于:所述硝酸纤维素膜上的检测线和标记垫上采用的O型口蹄疫抗原均为灭活O型口蹄疫病毒抗原、O型口蹄疫疫苗或O型口蹄疫结构蛋白VP1、VP2和VP3的重组蛋白；所述硝酸纤维素膜上质控线采用的羊抗鸡抗体为羊抗鸡IgY的IgG或者羊抗兔lgG。5.根据权利要求3所述的O型口蹄疫病毒抗体检测卡，其特征在于:所述标记在生物原料上的镧系荧光微球的镧系荧光是指镧系元素Eu、Sm或Tb与β—二酮配基产生的荧光。6.根据权利要求1所述的O型口蹄疫病毒抗体检测卡，其特征在于:所述样品垫为检测血清或血浆的样品垫，或者为检测全血的样品垫。7.根据权利要求1所述的O型口蹄疫病毒抗体检测卡，其特征在于:本检测卡利用猪血样品中O型口蹄疫病毒抗体、O型口蹄疫病毒抗原的标记物和硝酸纤维素膜上包被O型口蹄疫病毒抗原通过双抗原夹心法来检测猪血样本中O型口蹄疫病毒抗体。8.根据权利要求1所述的O型口蹄疫病毒抗体检测卡，其特征在于:本检测卡为定量层析检测卡，它是通过检测仪检测层析后检测卡的检测线和质控线发出的荧光信号，然后根据此批检测卡的IC卡储存的标准曲线，再由检测线和质控线的荧光信号从标准曲线计算出待检物的浓度。
【专利摘要】本实用新型公开了一种O型口蹄疫病毒抗体检测卡，包括装配在外壳内的检测卡本体，所述检测卡本体包括底板，在底板上依次设置样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述硝酸纤维素膜上包被O型口蹄疫抗原为检测线，包被羊抗鸡抗体为质控线，在外壳上对应样品垫开设加样孔，对应硝酸纤维素膜上的检测线和质控线开设视窗孔。本实用新型灵敏度高，检测的批内差及批间差小，有较好的重复性，性能稳定，可实现O型口蹄疫病毒抗体现场快速检测，具有较高的实用价值。
【IPC分类】G01N33/68, G01N33/569, G01N33/533, G01N33/558
【公开号】CN205333653
【申请号】CN201620057348
【发明人】常惠芸, 吴俊清, 邵军军, 章健, 赵付荣, 吴冠英, 张永光, 李明伟
【申请人】中国农业科学院兰州兽医研究所, 成都微瑞生物科技有限公司
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2016年1月21日