特异性吸附胞外囊泡的磁性材料、制法及基于上述磁性材料对翻译后蛋白质逐级洗脱富集的方法

本发明涉及一种特异性吸附胞外囊泡的磁性材料，还涉及上述磁性材料的制备方法及基于上述磁性材料对翻译后蛋白质逐级洗脱富集的方法。

背景技术：

1、蛋白质作为直接负责生物过程和表型的功能执行者被大量研究，其以多种形式发挥其生物学作用：(1)蛋白质的表达模式及其丰度以组织特异性的方式决定了基本的生物学功能，直接测量蛋白质使我们能够更直观地分析发挥作用的分子调控机制；(2)蛋白质磷酸化是激酶激活/失活的关键事件，这些激酶参与大多数生物过程，与人类疾病相关；(3)蛋白质糖基化大部分发生在膜表面，对细胞信息交互，癌症进展、侵袭和转移等至关重要。因此，多类型蛋白质组学的联合分析和动态描述，将为不同亚型乳腺癌的精准分析和早期诊断带来新的契机。

2、然而，体液中高丰度杂蛋白的含量远高于翻译后修饰蛋白质的含量，并且游离酶的存在导致体液中磷酸化蛋白质和糖基化蛋白质很少能够以稳定和可检测的浓度进行鉴定。这使得基于体液翻译后修饰蛋白质组学的疾病标志物筛选研究难以广泛开展，探寻更快速、有效、高通量的体液样本翻译后修饰蛋白质富集方案对疾病多类型蛋白质联合分析具有重大意义。

3、胞外囊泡是由细胞实时分泌至胞外的磷脂双分子层异质性群体，携带蛋白质、核酸等能够反映出源细胞生理状态的生物分子，通过体液循环传递给近端或远端的下游受体细胞，从而对下游细胞进行调节。对其进行分离和下游蛋白质组学的分析可有效避免外界游离杂蛋白质的干扰，提高低丰度蛋白质的鉴定结果，反映释放细胞的‘分子指纹’的动态变化。并且，基于体液胞外囊泡的疾病标志物也已被证明可以在肿瘤和其他疾病的症状发作或生理检测之前很早就被鉴定出来。这些优势使得胞外囊泡的研究越来越广泛，已逐渐成为翻译后修饰蛋白质组学的最佳样本来源。

4、迄今为止，常规胞外囊泡翻译后修饰蛋白质组学分析所需求样本量较大：一方面，胞外囊泡中翻译后修饰蛋白质的信息丰度远低于普通蛋白质的含量，大大增加样本处理和分析难度；另一方面，翻译后修饰蛋白质组学的研究，需对样本进行繁杂的富集操作，沿用该类方案将对痕量蛋白造成‘毁灭性的’信息损失。

技术实现思路

1、发明目的：本发明目的旨在提供一种特异性吸附胞外囊泡的磁性材料，本发明另一目的旨在提供上述磁性材料的制备方法及基于上述磁性材料对翻译后蛋白质逐级洗脱富集的方法，本发明方法利用功能化磁性纳米材料，进行微量体液中胞外囊泡的分离，随后原位裂解所吸附的胞外囊泡、富集蛋白质，最后实现糖基化肽段和磷酸化肽段的逐级洗脱、分别富集。

2、技术方案：本发明所述的特异性吸附胞外囊泡的磁性材料，以磁性纳米颗粒为载体，所述磁性纳米颗粒表面接枝有连接磷脂双分子层的结合分子以及连接磷酸基团的高亲和性离子；所述磁性纳米颗粒以铁基磁性纳米粒子为核，在铁基磁性纳米粒子外包裹有羧基化或氨基化修改的二氧化硅壳层。

3、其中，磷酸基团高亲和性离子为钛离子或锆离子。

4、其中，所述铁基磁性纳米粒子为四氧化三铁纳米粒子或三氧化二铁纳米粒子。

5、其中，所述磁性纳米颗粒的粒径为300～500nm；磁性纳米颗粒中，二氧化硅壳层的厚度为30～50nm。

6、其中，对于连接磷脂双分子层的结合分子，分子首端为磷脂双分子层结合分子本体，该类分子为1,2-二油酰基-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺、1-棕榈酰基-2-油酰基乙醇胺、1,2-二硬酯酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺、l-磷脂酰乙醇胺或胆固醇；磷脂双分子层结合分子本体以酰胺反应链接(连接)分子量为4000da的聚乙二醇长链，聚乙二醇长链另一端通过二硫键结合游离的羧基或氨基用于与磁性纳米颗粒进行键合。

7、上述磁性材料的制备方法，具体为：将磷脂双分子层结合分子和3-磷酰基丙酸，在ph＝5.5-6.0的2-(n-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中进行羧基活化；活化后，与磁性纳米颗粒在ph＝7.0-7.5的2-(n-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中进行酰胺反应，反应产物用水多次清洗后，加入硫酸钛或硫酸锆溶液进行反应，反应后多次清洗得到终产物。

8、基于上述磁性材料对翻译后蛋白质逐级洗脱富集的方法，具体为：将磁性材料加入到唾液、尿液、脑脊液、血浆或细胞培养液中，反应30～60分钟后，磁分离得到富集的体液中的胞外囊泡；而后进行10分钟裂解和9～12小时酶解，终止酶解后进行蛋白质的原位富集和不同翻译后修饰蛋白质的连续逐级洗脱，实现普通多肽、糖基化多肽和磷酸化多肽的富集；将依次洗脱后的产物进行液相-质谱分析，根据谱图结果得到不同翻译后修饰蛋白质的强度信息。

9、本发明功能化磁珠能被用于胞外囊泡的分离和翻译后修饰蛋白的富集与洗脱，解决了当前微量体液样本翻译后修饰蛋白质组学分析难以实现的问题，简化传统翻译后修饰蛋白质繁杂的富集过程、避免样品转管和其他富集材料的引入，大大缩短样品处理时间至12小时以内(传统方法需要48～60小时)，样本使用体积缩小至传统方法的二十分之一。

10、本发明的工作原理：本发明中所修饰的磷脂双分子层结合分子，作为磷脂膜成分类似物，已被证明能够有效锚定胞外囊泡膜结构；在胞外囊泡裂解过程中，裂解液中的三(2-羧乙基)膦破坏磷脂双分子层结合分子结构中的二硫键，使得1,2-二油酰基-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺、1-棕榈酰基-2-油酰基乙醇胺、1,2-二硬酯酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺、l-磷脂酰乙醇胺或胆固醇分子脱离磁性纳米颗粒表面，实现胞外囊泡从磁性纳米颗粒上的释放；后续胞外囊泡蛋白质样品酶解完成后，向体系中加入乙酸乙酯，1,2-二油酰基-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺、1-棕榈酰基-2-油酰基乙醇胺、1,2-二硬酯酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺、l-磷脂酰乙醇胺或胆固醇分子同胞外囊泡膜的磷脂分子一起被乙酸乙酯萃取。另一方面，磁性纳米颗粒表面钛或锆离子的引入是借助磷酸基丙酸的修饰来实现的，钛或锆离子多用于磷酸化多肽的富集，对磷酸基团有很高的选择性，同样对胞外囊泡膜磷脂分子也具有结合作用。因此利用磷脂双分子层结合分子和钛\锆离子对膜结构的亲和捕获，获得更高的胞外囊泡分离效率和特异性。酶解结束后，磁性纳米颗粒表面保留钛离子和聚乙二醇分子，对磁性纳米颗粒自身的亲水性没有影响，从而可以开展基于亲水色谱原理的普通多肽、糖基化多肽和磷酸化多肽的富集和逐级洗脱。

11、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著的优点：本发明利用磷脂双分子层结合分子和钛\锆离子修饰在磁性纳米颗粒表面后，与体液或细胞培养液中的胞外囊泡相互作用，30分钟后充分捕获胞外囊泡，磁分离得到胞外囊泡-磁性材料复合物，裂解和酶解后磁性纳米颗粒协同其表面的钛\锆离子能够进行所有蛋白的原位富集和不同翻译后修饰蛋白质的逐级洗脱(通过调整溶液中的ph)，实现胞外囊泡翻译后修饰蛋白质的快速富集与洗脱，从而有效降低检测成本，减少体液用量，增加样本使用率；因此本发明磁性纳米材料能够用于胞外囊泡特异性分离和下游蛋白质原位富集及不同翻译后修饰蛋白逐级洗脱，具有检测成本低、快速、高灵敏性以及重复性好的优点。