病理学分析。
[0021] (六）肝脏脂质含量分析 为检测肝脏中胆固醇和甘油三酯的含量，肝组织被匀浆，以lOOOXg的速度离心15分 钟后，取上清液进行分析。肝脏总胆固醇（TC)、游离胆固醇（FC)、甘油三酯（TG)、胆固醇酯 (CE)的浓度通过酶法（ApplygenTechnologiesInc.)检测，CE=TC-FC〇
[0022] (七）血清与肝脏氧化应激水平检测 氧化应激是非酒精性脂肪肝发生发展的重要因素，其水平可通过脂质过氧化产物丙二 醛(MDA)反映，同时活性氧的毒性作用可被抗氧化剂如超氧化物歧化酶（S0D)拮抗。在此， 将血清与肝脏内MDA水平、S0D活性通过相应的试剂盒(南京建成科技有限公司）进行检测。
[0023](八）肝脏内诱导型N0合酶（iNOS)活性和N0水平的检测 大量研究显示，非酒精性脂肪肝中iNOS和N0水平可明显升高，N0与超氧阴离子结合 形成过氧化亚硝酸盐，引起细胞蛋白发生氧化和亚硝基化反应，损伤肝细胞。在此，肝内N0 的水平和iNOS的活性通过相应的试剂盒(南京建成科技有限公司）检测。
[0024](九）统计学分析 统计学分析用GraphPadPrismprogrammever. 4.0进行单因素方差分析检验，结果显 示为平均值土标准差，尸<ft仍为有显著性差异。
[0025]二，结果 (一）天目琼花醇提物对apoE/小鼠血脂的影响 由表1可知，高脂喂饲8周后，模型组apoE/小鼠血浆TC、HDL-C、LDL-C水平均明显升 高。给予高剂量天目琼花后，apoE/小鼠TC、TG和LDL-C水平分别降低了 22. 77%、11. 88%和 22. 42%，降脂效果显著。同时，天目琼花中、高剂量组HDL-C分别升高了 16. 28%和53. 48%。
[0026] 表1天目琼花醇提物对高脂喂饲apoE/小鼠血脂的影响
#尸汲似和对照组相比；防/似和模型组相比。
[0027](二）在高脂喂饲的apoE/小鼠中，天目琼花醇提物改善了脂肪肝的病理学变化， 减轻了肝损伤。
[0028] 口服天目琼花醇提物8周后，通过HE染色显示脂肪肝的组织病理学变化。由图1A 可见，对照组肝小叶结构正常，中央静脉及外周肝索规则。高脂饮食8周后，肝细胞内出现 了大量脂滴，部分肝细胞出现了肿胀、变性甚至坏死。口服天目琼花后肝组织的病理学改变 得到明显改善，呈剂量依赖性。天目琼花高剂量组效果与辛伐他汀相似。
[0029] 当肝细胞发生炎症、坏死等损伤时，转氨酶可释放到血液里，导致血清转氨酶升 高。因此血清转氨酶水平是临床反映肝细胞损伤的敏感指标。由图1B和1C可知，高脂饮 食引起了血清和肝脏中ALT和AST活性明显升高，口服天目琼花和辛伐他汀后此升高得到 了逆转，相比于高脂模型组，天目琼花各剂量组对ALT和AST的抑制作用显著。其中高剂 量组中ALT、AST分别下降18. 46%和27. 02。
[0030] (三）在高脂喂饲的apoE/小鼠中，天目琼花醇提物调节了肝内胆固醇代谢，明显 减轻了肝内脂质沉积。
[0031] 脂质在肝细胞内沉积是非酒精性脂肪肝发生发展的必要条件。由图2可见，与对 照组相比，模型组的TC、FC、CE和TG含量明显增加。口服天目琼花醇提液后，肝内TC、FC和 CE水平呈剂量依赖性降低，天目琼花高剂量的效果与辛伐他汀相似。相比于高脂模型组，高 剂量组apoE7小鼠肝内TC、FC和CE水平分别降低了 20. 64 %、28. 92%和14. 48%，TG水平 下降 26. 26%。
[0032] (四）天目琼花醇提物降低高脂喂饲的apoE/小鼠肝脏和血清氧化应激水平。
[0033] MDA为脂质过氧化产物，是反映体内氧化应激水平的最常用检测指标，S0D为抗氧 化剂。由图3可见，喂饲高脂饮食后，血清中内MDA含量明显升高（图3A)，S0D活性显著降 低（图3B)。与模型组相比，高剂量天目琼花降低了MDA水平分别达32. 75%，S0D活性升高 16. 15% ;肝脏中MDA降低了 34. 40% (图 3C)，S0D活性升高了 25. 20% (图 3D)。
[0034] (五)在高脂喂饲的apoE/小鼠中，天目琼花醇提物降低了肝内N0和iNOS的水平。
[0035] 除活性氧（R0S)外，活性氮（RNS)也可引起肝细胞损伤和细胞炎症反应。其中，N0 和超氧阴离子结合生成的过氧化亚硝酸盐是最主要的活性氮，它可以引起蛋白氧化和亚硝 基化，导致线粒体内多种呼吸酶的功能紊乱。McKim等人报道非酒精性脂肪肝时N0增多主 要是iNOS活性增强诱导。由表2可见，模型组肝内NO和iNOS水平升高，而天目琼花明显 降低了iNOS的活性，减少了NO的产生。其中，高剂量组iNOS活性降低22. 05%，NO水平减 少 51. 06%。
[0036] 表2天目琼花醇提物抑制了高脂喂饲apoE/小鼠肝组织iNOS和N0的表达
版和对照组相比；版和模型组相比。 当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的 技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护 范围。
【主权项】
1. 天目琼花醇提物在制备治疗非酒精性脂肪肝药物中的应用。2. 根据权利要求1所述的天目琼花醇提物在制备治疗非酒精性脂肪肝药物中的应用， 其特征在于，所述醇提物的提取方法为：将天目琼花果实常温晒干，然后研磨成40目粗粉， 取500g粉末于95%的乙醇中提取，所述粉末与乙醇的质量体积比为1 :10,醇提物过滤后浓 缩成浸膏，每克浸膏相当于3. 49g生药，然后将浸膏用5%的羧甲基纤维素钠分别配制成2. 5 g生药/ml，5.Og生药/ml，10.Og生药/ml，4°C保存备用。
【专利摘要】本发明涉及天目琼花醇提物在制备治疗非酒精性脂肪肝病(NAFLD)药物中的应用。本发明采用高脂饮食诱导的apoE-/-？NAFLD模型，以辛伐他汀作为阳性对照药，给予天目琼花醇提物口服8周后，观察天目琼花醇提物对NAFLD的影响，并探索相应机制，结果显示，天目琼花醇提物明显改善了高脂诱导的肝组织病理学改变，减轻了肝细胞的损伤，降低了肝内脂质蓄积，抑制了肝内氧化应激反应。本发明既开发了天目琼花醇提物的新用途，又为治疗NAFLD提供了一条新途径。
【IPC分类】A61P1/16, A61K36/35
【公开号】CN105168303
【申请号】
【发明人】张颖, 秦树存, 张磊, 郭守东, 庞晓飞, 宋园园
【申请人】泰山医学院
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年9月30日