高效诱导成体细胞表观重编程的试剂盒及其方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种高效诱导成体细胞表观重编程的试剂盒及其方法，属于细胞生物技术领域。
【背景技术】
[0002]干细胞(Stem cell)是一类具有自我更新(Self-renewal)和多向分化(Multilineage differentiat1n)潜能的细胞，可用于生命体的发生、发展规律及衰老、死亡等的机制研究，并被广泛用于再生医学(Regenerative medicine)领域等。当前，从成体组织中分离获得多能干细胞的数量非常有限，常不能满足治疗需要；而直接从发育早期胚胎中获得干细胞存在严重的伦理问题，干细胞的来源严重限制了其在临床上的研究和应用。
[0003]成体细胞重编程(Somatic cell reprogramming)技术的出现为干细胞的来源提供了新的思路和方法。当前成体细胞重编程方法主要有核移植(Nuc I ear transfer )、细胞融合(Cell fus1n)、转录因子介导(Transcript1n-factor transduct1n)、小分子化合物诱导(Small-molecule compounds)等(Yamanaka S et al, Nature, 2010,465 (7299):704-712 ；Hou P et al, Science,2013,341(6146):651, 654)0
[0004]核移植的基本思想就是将成体细胞核移植到去核的卵母细胞中，经过培养和胚胎移植，最后发育成一个与供体核基因组完全相同的个体。因此，从某种意义上来说，利用该方法产生的细胞具有胚胎干细胞的全能性特征。目前，利用核移植技术已克隆出包括克隆羊“多利”(Dollly)在内的十几个物种。但由于该方法技术难度大，成本高和效率低，目前该方法主要用于转基因动物的生产，在临床应用方面尚存很多问题。
[0005]细胞融合技术能够产生干细胞主要是基于以下理论:在大多数情况下，两种细胞融合后形成的杂种细胞(Hybrid cell )，其分化程度低的细胞表型(Phenotype)对分化程度高的细胞表型呈显性(Dominance )。因此，利用胚胎干细胞或多能干细胞系与成体细胞共培养，则杂种细胞可呈现明显的干细胞特征。利用这种方法产生的融合细胞虽然具有干细胞特征，但这种杂种细胞改变了遗传物质的组成，且在细胞生长、增殖和分化特性方面发生了显著改变。因此，此类细胞在临床应用上存在明显的安全问题。利用这种方法产生的细胞主要用于基因表达调控研究。
[0006]2006 年，诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)的出现使得成体细胞重编程研究达到了顶峰。iPSCs的产生是利用包含转录因子Nanogm因在内的四个基因导入到成体细胞基因组中，使得核基因组表达模式重新编程(TakahashiK et al, Cell, 2006，126(4): 663-676; Park IH et al, Nature, 2008，451 (7175):141-146)。这种重编程的结果最终导致干细胞多能性相关基因的开启，促使重编程细胞呈现和维持干细胞的特性。iPSCs的诱导成功使得干细胞避免了在来源上胚胎干细胞的伦理问题和在治疗上异体的免疫排斥问题。但是由于iPSCs的产生需要病毒载体介导，同时，诱导因子的介入改变了成体细胞核基因组组成，因此其在体内的安全性难以控制。此外，这方方法的诱导效率很低，目前仍处于基础研究和试验阶段，不适于临床治疗应用。为了克服转录因子介导带来的问题，最近，中国科学家利用几种小分子化合物(Small-moleculecompound)组合成功将鼠成体细胞重编程为iPSCs (Hou P et al, Science，2013，341 (6146):651, 654)，这种方法避免了基因操作带来的安全性，但是这种方法的诱导效率依然很低(大约0.2%)，因此，在现有研究条件下，应用于临床应也尚有难度。
[0007]由上可以看出，利用上述方法将成体细胞重编程为具有多能干细胞特性的诱导多能干细胞是可行的，但是上述方法均存在明显弊端，因此，寻求一种制备方法更为简单、临床应用更为安全、诱导效率更为高效的成体细胞重编程方法是当前面临的重要课题。
[0008]核移植技术和细胞融合技术表明低分化水平细胞中存在能够诱导细胞重编程的物质。此外，已有研究也表明利用低等水生生物蛙卵母细胞提取物能够诱导人成体细胞中干细胞多能性维持基因表达水平升高，提示蛙卵细胞提取物对人成体细胞重编程过程有重要作用。由于细胞提取物属生物活性物质，其在诱导细胞重编程过程中对细胞的伤害程度更低，同时，细胞提取物的重编程过程不涉及细胞内基因导入，重编程细胞的核基因组组成和结构也不发生改变。
[0009]可见，低等水生生物卵母细胞提取物是一种非常优良的成体细胞表观重编程诱导剂，利用其制备诱导多能干细胞是一种比核移植和细胞融合更具吸引力的方法。
[0010]据此，本发明利用天然淡水生鱼卵母细胞提取物为成体细胞表观重编程诱导剂，通过对成体细胞的诱导培养以获得诱导多能干细胞(induced multipotent stem cells，iMSCs)。诱导细胞经过形态学、细胞生物学以及分子生物学等技术鉴定表明诱导细胞具有多能干细胞的生物学特征。本发明建立的成体细胞表观重编程方法具有诱导方法简单、诱导效率高和无病毒载体介入等特点，本发明方法可为复杂疾病治疗及再生医学工程提供种子细胞来源。
【发明内容】
[0011]本发明的目的在于针对现有成体细胞重编程方法存在诱导效率低等的问题，提出用于高效制备多能干细胞的成体细胞表观重编程方法。
[0012]本发明所提供的用于制备多能干细胞的成体细胞重编程方法包括以下步骤:
(1)诱导剂的制备使用的成体细胞重编程诱导剂为卵母细胞提取物；
(2)成体细胞的制备使用的成体细胞为成纤维细胞；
(3)成体细胞诱导使用步骤(I)中制备的诱导剂对步骤(2)中制备的成纤维细胞进行诱导；
(4)特性鉴定使用细胞形态学、免疫细胞和免疫组织化学、细胞生物学以及分子生物学技术对步骤(3)中诱导产生的细胞进行特征鉴定。
[0013]所述步骤(I)中使用的卵母细胞为鱼卵母细胞，使用的鱼类为淡水生鱼类，包括鲫鱼、鲤鱼和草鱼，卵母细胞提取物采用反复冻融法制备；
所述步骤(2)中的成纤维细胞来源于成年动物皮肤组织；
所述步骤(3)中进行高效诱导使用的培养基为DMEM培养基，鱼卵母细胞提取物为诱导剂；
所述步骤(4)中使用的用于诱导细胞特征鉴定的免疫细胞和免疫组织化学方法为免疫染色法，鉴定表达基因为干细胞标志基因&M、5bx身P细胞生物学鉴定方法为诱导细胞的体内(/λ Kira)和体外(ii? Kiiro)定向诱导；分子生物学方法鉴定采用干细胞标志基因启动子区域的甲基化特征分析。
[0014]本发明的另一目的是提出用于高效制备诱导多能干细胞的诱导成体细胞重编程试剂盒。
[0015]用于高效制备诱导多能干细胞的诱导成体细胞重编程试剂盒包括:
(O成体细胞表观重编程诱导剂；
(2)成体细胞和诱导细胞培养基
所述试剂盒中试剂或试剂制备材料均可通过商业生物公司或试剂公司购买得到。
[0016]本发明具有实质性特点和显著性进步，本发明针对现有成体细胞重编程方法的不足，创造性地利用天然鱼卵母细胞提取物作为成体细胞重编程的诱导剂，实现了将成体细胞重编程为诱导多能干细胞，解决了干细胞来源困难的问题，同时避免了胚胎干细胞临床应用的伦理争议以及iPSCs诱导效率及安全性低的问题。本发明成体细胞重编程方法属干细胞基础与临床技术，该技术具有细胞重编程方法简单、诱导周期短、诱导过程不损伤细胞、制备的干细胞安全性好、重编程效率高、研究成本低等特点，具有良好的应用前景。
【附图说明】
[0017]图1是高效诱导成体细胞表观重编程流程图；
图2是人成体细胞从皮肤组织中分离；
图3是人皮肤组织成纤维细胞的培养；
图4是诱导成体细胞干细胞标志基因表达检测；
图5是诱导成体细胞干细胞标志基因达检测；
图6是诱导成体细胞干细胞标志基因表达检测；
图7是诱导成体细胞的体内分化研究(畸胎瘤的形成)；
图8是诱导成体细胞向