，需要进行科学的安全性能评价，诱导多能干细胞临床应用动物模型是安全性能评价最为重要和科学的方法，而获得模型动物诱导多能干细胞是建立动物模型的关键。
[0040]利用高效诱导成体细胞表观重编程试剂盒进行鼠诱导多能干细胞的制备。
[0041]诱导结果显示，利用试剂盒诱导的鼠成体细胞表达多能干细胞标志基因(图13)；诱导成体细胞移植裸鼠体内两周后能够形成畸胎瘤(图14);诱导成体细胞在定向诱导培养基的诱导下，能够分化为特定的细胞类型(图15)。以上结果均表明，利用高效诱导成体细胞表光重编程试剂盒诱导的鼠成体细胞具有明显的多能干细胞特性，说明利用该试剂盒能够成功制备鼠多能干细胞。
[0042]从以上可以看出，使用本成体细胞表观重编程方案可以在相对低的研究成本下，高效获得临床上较为安全的诱导多能干细胞，诱导多能干细胞的获得可为临床干细胞提供可靠的来源，具有良好的应用价值和推广前景。
【主权项】
1.高效诱导成体细胞表观重编程方法，其特征在于包括如下步骤: (1)诱导剂的制备； (2)成体细胞的制备； (3)成体细胞诱导； (4)特性鉴定； 所述步骤(I)中诱导剂为天然淡水鱼卵母细胞提取物； 所述步骤(2)中成体细胞为动物皮肤组织成纤维细胞； 所述步骤(3)中诱导细胞培养基为DMEM培养基； 所述步骤(4)中诱导细胞特性鉴定包括细胞形态学、免疫细胞化学、细胞生物学和分子生物学方法。2.采用权利要求1所述高效诱导成体细胞表观重编程方法，其特征在于，步骤(I)中诱导剂的制备方法为:选取卵黄充满卵母细胞时相的鲫鱼一条，置于75%的酒精溶液中浸泡30分钟，取出后采用头部后侧击打的方法将鲫鱼致死，然后用手术刀从泄殖腔处划开鲫鱼腹部，无菌取出鱼卵后置于50ml无菌离心管中，随即投入液氮中5分钟，然后置于4°C条件下解冻(大约10分钟)，反复3次后按体积比为1:1的比例加入生理盐水，在研钵中充分研磨后100rpm离心10分钟，然后在3000rpm离心10分钟后取上清，200目分子筛过滤，考马斯亮蓝法测定卵母细胞提取物总蛋白浓度，稀释成100mg/ml浓度后4°C保存备用。3.采用权利要求1所述高效诱导成体细胞表观重编程方法，其特征在于，所述步骤(2)中成体细胞的制备方法包括成纤维细胞的分离和培养两个环节，其方法分别为:(1)成纤维细胞的分离方法:用碘酒对鼠腹部皮肤组织进行旋转消毒，用手术剪剪去毛发，用手术刀剪取2~3cm2的皮肤，置于含有100U/ml (U为国际单位)氨苄青霉素和100mg/ml硫酸链霉素、pH 值为 7.4 的磷酸盐缓冲溶液(Phosphate buffered solut1n，PBS, IL pH 为 7.4 的PBS 包括 8.0g NaCU0.2g KCl、1.44g Na2HPOjP 0.24g KH 2P04)中，漂洗 3 次后，剪弃脂肪组织和结缔组织，将皮肤剪成约Imm3左右的组织块，加入含有胶原酶200U/ml、透明质酸酶300U/ml的DMEM培养基中，置于4°C过夜，按照1:1的比例加入含有0.25%胰酶和0.02%的乙二胺四乙酸(Ethylenediamin etetraacetic acid, EDTA)的 PBS 消化液，置于 180 rpm、37°C空气摇床20min，加入血清终止反应，1000 rpm离心1min收集细胞；(2)成纤维细胞的培养方法为:用DMEM培养基将分离的细胞洗脱2次后，用含有15%胎牛血清的DMEM培养基调整细胞密度为每毫升约2?4X 15个，然后将细胞浓度调整后的细胞接种于培养瓶中，置于37°C、5%C02，、90%湿度条件下培养，每两天更换一次DMEM培养基，培养48小时后，可见成纤维细胞基本铺满整个培养皿底部。4.采用权利要求1所述高效诱导成体细胞表观重编程方法，其特征在于，所述步骤(3)中成体细胞诱导方法为:将步骤(2)中的细胞进行传代培养，当传至第四代且细胞达到80%的细胞融合时，添加步骤(I)中制备的卵母细胞提取物，培养基与卵母细胞提取物的比例为100:1，诱导培养条件与步骤(2)中成纤维细胞的培养条件相同，诱导培养时间为12小时。5.采用权利要求1所述高效诱导成体细胞表观重编程方法，其特征在于，所述步骤(4)中诱导细胞特性鉴定包括的细胞形态学观察方法为:将步骤(3)中诱导12小时的成体细胞置于电子显微镜下观察。6.采用权利要求1所述高效诱导成体细胞表观重编程方法，其特征在于，所述步骤(4)中诱导细胞特性鉴定包括的免疫细胞化学方法为；将步骤(3)中诱导好的细胞与对照组细胞分别用4%多聚甲醛固定lOmin，用PBS冲洗5minX3次，加入0.3%Triton_100，停置5min，PBS冲洗5minX 3次，加入3% H2O2,停置5min，PBS冲洗5minX 3次，在标记好的孔中分别加入鼠抗人Oct3/4、Sox-2、Nanog和Ciyc抗体，4°C过夜，PBS冲洗5minX 3次，滴加生物素化二抗，37°C孵育20min，用PBS洗涤5minX 3次，加入DAB试剂，室温显色5min?1min(镜下观察控制)，PBS洗涤后置于电子显微镜下观察。7.采用权利要求1所述高效诱导成体细胞表观重编程方法，其特征在于，所述步骤(4)中诱导细胞特性鉴定包括的细胞生物学方法为诱导细胞的体内和体外分化，诱导细胞的体内分化方法为:收集大约IX15个步骤(3)中诱导的成体细胞注射于裸鼠皮下组织，一周后，无菌取出诱导细胞分化形成的畸胎瘤，利用病理组织学和免疫组织化学进行组织成分分析。8.采用权利要求1所述高效诱导成体细胞表观重编程方法，其特征在于，所述步骤(4)中诱导细胞特性鉴定包括的细胞生物学鉴定方法中诱导细胞的体外分化方法包括步骤(3)中诱导细胞向成骨细胞、脂肪细胞和神经细胞分化诱导，其中， 成骨细胞诱导方法为:将密度为3.lX103/cm2步骤(3)中诱导的成体细胞接种于六孔板中，加入完全培养基后置于37°(:、5%0)2的培养箱中培养24小时，24小时后更换培养基，每孔添加2ml的成骨分化诱导液进行诱导，每2天换成骨分化完全培养基一次，诱导3周后固定细胞，用茜素红进行染色； 脂肪细胞诱导方法为:将密度为2.1 X 1Vcm2步骤(3)中诱导的成体细胞接种于六孔板中，加入完全培养基，放置于37°C、5%0)2的培养箱中培养24小时，24小时后更换培养基，此后，每3天换完全培养基一次，直至细胞达到完全融合；细胞完全融合后，小心吸弃旧培养基，每孔加2ml成脂分化诱导完全培养A，三天后，将分化诱导液换为成脂分化诱导完全培养基B，24小时后，再换回成脂分化诱导完全培养基A，循环3到5次后，用成脂分化诱导完全培养基B维持7天，每3天进行换液，诱导完成后固定细胞，用油红O进行染色； 神经细胞分化诱导方法为:将5X105个步骤(3)中诱导的成体细胞接种于六孔板中，用含有100 ymol/L β-ME ^ 20% CS的L-DMEM培养基诱导培养24小时，换成含有I ymol/L RAUOO mmol/L β-ME,10% CS的L-DMEM诱导培养至10天后，用4%的多聚甲醛固定，检测神经元标志物NSE、nestin的表达。9.高效诱导成体细胞表观重编程试剂盒，其特征在于该试剂盒包括: (O成体细胞表观重编程诱导剂； (2)成体细胞与诱导细胞培养基。10.采用权力要求9所述高效诱导成体细胞表观重编程试剂盒，其特征在于，试剂盒包含(I)中成纤维细胞表观重编程诱导剂制备方法同权力要求2中诱导剂制备方法。11.采用权力要求9所述高效诱导成体细胞表观重编程试剂盒，其特征在于，试剂盒包含(2)中成体细胞与诱导细胞培养基为DMEM培养基。
【专利摘要】高效诱导成体细胞表观重编程方法及试剂盒，属于细胞生物技术领域。该方法及其试剂盒针对现有成体细胞重编程方法存在的问题，发明了一种利用天然活性物质—鱼卵母细胞提取物为诱导剂，高效诱导成体细胞表观重编程为诱导多能干细胞的方法，可用于动物多能干细胞的制备。本发明涉及的方法及试剂盒能够高效诱导动物成体细胞重编程为诱导多能干细胞，与其它方法相比，该方法对成体细胞的重编程效率高，诱导方法简单、安全性好、成本较低，本发明方法解决了多能干细胞来源困难的问题，在再生医学等领域具有广阔的临床应用价值和前景。
【IPC分类】C12N5/074, C12N5/079, C12N5/071, C12N5/077
【公开号】CN105670989
【申请号】
【发明人】潘兴华, 朱向情, 陈强
【申请人】朱向情
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2014年11月18日