经遗传修饰的非人动物及其使用方法
【专利说明】经遗传修饰的非人动物及其使用方法
[0001]对相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2012年9月7日提交的美国临时申请流水号61/698，002，和2013年3月8日提交的美国临时申请流水号61/775，171的优先权，每篇的内容通过提及完整收入本文。
[0003]发明背景
[0004]生物医学研宄的目的是更好地了解人生理学以及使用此知识来预防、治疗或治愈人疾病。由于对人受试者进行实验的实际和伦理障碍，许多研宄是对小型动物模型(诸如小鼠)进行的。然而，小鼠并不是人，并且自动物实验获得的知识不总是适用于人。在此背景中，用人血液-淋巴样系统(HHLS)再殖(repopulate)的小鼠代表一种用于在体内研宄人造血和免疫功能的有用小型动物模型。
[0005]HHLS小鼠是通过将人造血干细胞和祖细胞(HSPC)和/或人胎儿组织移植入免疫应答的先天性和适应性分支有缺陷的接受者小鼠中生成的。在20世纪80年晚期开发出HHLS 小鼠的第一种模型(Mosier 等，1988，Nature335:256-259 ；McCune 等，1988，Science241:1632-1639 ； Kame 1-Re id 和 Dick, 1988，Science 242:1706-1709)，并且自此以后已经经历了一系列改良(Legrand 等，2006，Journal of Immunology 176:2053-2058 ;Shultz等，2007，Nature Reviews Immunology 7:118-130)。目前作为接受者用于人造血移入的小鼠品系共享三项特征。第一，它们由于编码PRKDC蛋白的基因中的Scid突变(Mosier等，1988, Nature 335:256-259 ;McCune 等，1988，Science241:1632-1639)，或者由于两个Rag基因之一的删除(Shultz 等，2000，Journal of immunology 164:2496-2507 ;Traggiai等，2004，Science 304:104-107)而缺乏B和T细胞。第二，编码细胞因子受体的共同Y链(γ。)的I12rg基因的删除或突变消除IL-15信号传导，并且导致NK细胞的缺失(Traggiai 等，2004，Science304:104-107 ；Ito 等，2002，Blood 100:3175-3182)。第三，小鼠巨噬细胞上表达的SIRPA受体和人细胞上的⑶47配体之间的相互作用对小鼠巨噬细胞提供抑制信号，并且为人异种移植物赋予吞噬细胞耐受性(Takenaka等，2007，NatureImmunology 8:1313-1323 ；Takizawa 和 Manz, 2007，Nature Immunology8:1287-1289)。在使用含有Sirpa基因中的天然多态性的NOD遗传背景时(Takenaka等，2007, NatureImmunology 8:1313-1323 ；Takizawa 和 Manz, 2007，Nature Immunology 8:1287-1289;Legrand 等，2011，Proc Natl Acad Sci USA108:13224-13229)或者通过人 SIRPA 基因的BAC 转基因表达(Strowig 等，2011，Proc Natl Acad Sci USA 108:13218-13223)实现小鼠细胞上表达的SIRPA和人⑶47之间的物种间相互作用。在使用NOD Scidy (NOG (Ito等，2002，BloodlOO:3175-3182)或 NSG(Ishikawa 等，2005，Blood 106:1565-1573))或hSIRPAtg RAG2vU/-(SRG(Strowig等，2011，Proc Natl Acad Sci USA108:13218-13223))小鼠作为接受者时在人HSPC移植后实现高水平的人造血细胞移入。
[0006]虽然在这些接受者品系中观察到人多谱系造血发生，但是大多数人细胞类型的终末分化、稳态和/或效应器功能是亚最佳的。已经假设此状况是由于由小鼠组织分泌的细胞因子和造血细胞上表达的人受体之间的交叉反应性降低或缺失所致(Manz, 2007, Immunity26:537-541 ;Willinger 等，2011，Trends in Immunology 32:321-327)。为了避开此限制，已经开发出数种策略来在小鼠宿主中投递人细胞因子。这些方法包括注射重组细胞因子(Lapidot 等，1992，Science 255:1137-1141 ；van Lent 等，2009，J.1mmunol 183:7645-7655)，细胞因子编码 cDNA 的慢病毒投递(O，Connell 等，2010，PloSOne 5 ⑶:e 12009)，质粒 DNA 的水动力学注射(Chen 等，2009，Proc Natl Acad SciUSA106:21783-21788)，cDNA 的转基因表达(Nicolini 等，2004，Leukemial8 (2):341-347 ；Brehm 等，2012，Blood 119:2778-2788 ；Takagi 等，2012，Bloodll9:2768_2777)或细胞因子编码基因的敲入替换(Rongvaux 等，2011，Proc Natl Acad Sci USA 108:2378-2383 ；Willinger 等，2011，Proc Natl Acad Sci USA108:2390-2395 ;Rathinam 等，2011，Blood118:3119-3128)。后一种方法具有人基因的更为生理性的表达的优点。此外，若人细胞因子在小鼠受体上不是完全交叉反应性的，则它能在小鼠细胞群体中诱导缺陷，并且对人细胞赋予额外的竞争优势。使用敲入基因替换策略，编码血小板生成素的基因(Tpo)的人源化导致功能性人造血干细胞的维持更好和骨髓中的移入增加(Rongvaux等，2011，Proc NatlAcad Sci USA 108:2378-2383);编码白介素_3和GM-CSF的基因(113和Csf2)的替换诱导小鼠肺泡巨噬细胞(AM)的丧失和功能性人AM的发生(Willinger等，2011，Proc NatlAcad Sci USA 108:2390-2395);并且Csfl基因(其编码M-CSF)的替代导致多种组织中人单核细胞的数目增加(Rathinam 等，2011，Blood 118:3119-3128)。
[0007]人和小鼠造血-淋巴样系统在许多方面不同(Haley, 2003,Toxico1gy188:49-7 I ；Mestas 和 Hughes, 2004, J Immunol172:2731-2738) o两个物种间的主要差异之一在于它们的白血球(WBC)微分。人血液富含髓样细胞，占总WBC的50-75 %。比较而言，小鼠血液以淋巴细胞占优势，并且仅20-30 %的WBC是髓样谱系的。此物种差异(尚未了解其功能和进化意义)在常规HHLS小鼠(诸如N0G/NSG或SRG)中没有重演。实际上，人髓样发生在这些宿主中是特别有缺陷的，其中髓样细胞仅占人WBC的5-10%。
[0008]具有功能性人免疫系统的小鼠的一项应用是开发和测试人疫苗。在历史上，免疫应答的体内诱导相对低效(2004，Traggiai 等，Science 304:104-107 ；2002, Ito 等，Blood100:3175-3182 ；2005, Ishikawa 等,Blood 106:1565-1573 ；2005,Shultz 等,J Immunol174:6477-6489 ;2006，Baenziger 等，Proc Natl Acad Sci USA 103:15951-15956)。数项研宄已经报告了感染后成功的病原体特异性免疫应答。虽然报告了 50%左右的小鼠在登革热病毒感染后生成病毒特异性IgM和IgG(2007，Kuruvilla等，Virology 369:143-152)，但是其它研宄报告了在HIV和EBV感染后生成抗原特异性IgM和IgG的小鼠的频率低于 20% (2006，Baenziger 等，Proc Natl Acad Sci USA 103:15951-15956 ；2008, Yajima等，J Infect Dis 198:673-682) ?在用佐剂和抗原免疫后，抗原特异性免疫球蛋白的类别转换在历史上也是低效的，仅一部分经免疫动物显示抗原特异性IgG应答(2004，Traggiai等，Science 304:104-107 ；2002, Ito 等，Blood 100:3175-3182 ；2005, Ishikawa 等，Blood106:1565-1573 ；2005,Shultz 等，J Immunol174:6477-6489 ；2009,Watanabe 等，IntImmunol 21:843-858 ；2010, Becker 等，PLoS ONE 5) o 这些研宄包括 NSG 和 BALB/cRAG2+y广小鼠和不同佐剂/抗原组合。
[0009]本领域中需要能够支持和维持人造血细胞移入的人源化非人动物。本发明解决本领域中没有得到满足的这种需要。
[0010]发明概述
[0011]一般而言，本发明涉及表达人M-CSF、人IL-3、人GM-CSF、人SIRPA或人TPO中至少一种的经遗传修饰的非人动物及其使用方法。如此，在一个实施方案中，本发明是经遗传修饰的非人动物，其包含基因组，该基因组包含编码下组中至少一种的至少一种核酸:人M-CSF、人IL-3、人GM-CSF、人SIRPA和人ΤΡ0，其中所述至少一种核酸与启动子可操作连接，且其中所述动物表达至少一种选自下组的多肽:人M-CSF、人IL-3、人GM-CSF、人SIRPA和人ΤΡ0。在另一个实施方案中，本发明是经遗传修饰的非人动物，其包含基因组，该基因组包含编码人M-CSF的核酸、编码人IL-3的核酸、编码人GM-CSF的核酸、编码人SIRPA的核酸和编码人TPO的核酸，其中编码人M-CSF、人IL-3、人GM-CSF、人SIRPA和人TPO的核酸中每种与启动子可操作连接，且其中所述动物表达人M-CSF多肽、人IL-3多肽、人GM-CSF多肽、人SIRPA多肽和人TPO多肽。在一些实施方案中，经遗传修饰的非人动物是免疫缺陷的。在一些实施方案中，经遗传修饰的非人动物不表达重组活化基因2(1^^-2+)。在一些实施方案中，经遗传修饰的非人动物不表达IL2受体γ链(γ链_勺。在一些实施方案中，经遗传修饰的非人动物不表达Rag-2，并且经遗传修饰的非人动物不表达IL2受体γ链(Rag-2+γ链_勺。在一些实施方案中，经遗传修饰的非人动物是啮齿动物。在一些实施方案中，经遗传修饰的非人动物是小鼠。在一个实施方案中，经遗传修饰的非人动物还包含至少一种人造血细胞。在一个实施方案中，经遗传修饰的非人动物还包含至少一种人癌细胞。在一些实施方案中，人癌细胞是白血病细胞或黑素瘤细胞。
[0012]在另一个实施方案中，本发明是一种在经遗传修饰的非人动物中移入造血干细胞和祖细胞(HSPC)的方法，其中所述动物表达下组中至少一种:人M-CSF、人IL-3、人GM-CSF、人SIRPA和人ΤΡ0，所述方法包括下述步骤:对表达下组中至少一种的经遗传修饰的动物施用至少一种HSPC:人M-CSF、人IL-3、人GM-CSF、人SIRPA和人ΤΡ0。在一些实施方案中，HSPC是人HSPC。在一个实施方案中，经遗传修饰的非人动物是啮齿动物。在一个实施方案中，经遗传修饰的非人动物是小鼠。在一个实施方案中，经遗传修饰的非人动物是免疫缺陷的。在一个实施方案中，经遗传修饰的免疫缺陷非人动物不表达重组活化基因2 (Rag-2V0。在一个实施方案中，经遗传修饰的免疫缺陷非人动物不表达内源IL2受体(γ链+)。在一个实施方案中，经遗传修饰的免疫缺陷非人动物不表达内源Rag-2且不表达内源γ链(Rag-2+γ链_勺。在一个实施方案中，经遗传修饰的动物包含人癌细胞。在一个实施方案中，人癌细胞是白血病细胞或黑素瘤细胞。
[0013]在另一个实施方案中，本发明是经遗传修饰的Rag-2+、γ链+小鼠，其具有基因组，该基因组包含编码下组中至少一种的至少一种核酸:人M-CSF、人IL-3、人GM-CSF、人SIRPA和人ΤΡ0，其中所述至少一种核酸与至少一种启动子可操作连接，其中所述小鼠表达至少一种选自下组的多肽:人M-CSF、人IL-3、人GM-CSF、人SIRPA和人ΤΡ0。在一个实施方案中，经遗传修饰的非人动物包含基因组，该基因组具有编码人M-CSF的核酸、编码人IL-3的核酸、编码人GM-CSF的核酸、编码人SIRPA的核酸和编码人TPO的核酸，其中编码人M-CSF、人IL-3、人GM-CSF、人SIRPA和人TPO的核酸中每种与启动子可操作连接，且其中所述动物表达人M-CSF多肽、人IL-3多肽、人GM-CSF多肽、人SIRPA多肽和人TPO多肽。在一个实施方案中，经遗传修饰的非人动物是啮齿动物。在一个实施方案中，经遗传修饰的非人动物是小鼠。在一个实施方案中，经遗传修饰的非人动物包含人造血细胞。在一个实施方案中，经遗传修饰的非人动物包含人癌细胞。在一些实施方案中，人癌细胞是白血病细胞或黑素瘤细胞。
[0014]附图简述
[0015]在结合附图阅读时会更好地理解本发明的优选实施方案的以下详细描述。为了例示本发明，在图中显示了目前优选的实施方案。然而，应当理解本发明不限于图中显示的实施方案的精确排列和手段。
[0016]图1 (包括图1A-1E)描绘了实验结果，其显示了 MISTRG小鼠支持高水平的人造血移入。通过肝内注射100，000个人胎儿肝-(FL-)⑶34+细胞移入经X射线预先条件化的指定品系的新生小鼠。在7-9周后在血液中及在10-12周后在BM中测量人移入水平(hCD45+细胞)。(图1A)指定接受者小鼠的血液和BM中小鼠和人CD45+细胞的频率的代表性流式细胞术分析。门控区旁边的数字指示总CD45+细胞间的百分比。(图1B)来自19项独立实验的血液移入水平(％h⑶45+细胞)的组合数据。在每项实验中，将单一 FL-⑶34+细胞样品拆分，并注射入相应品系的小鼠中。每个符号代表一只小鼠个体，并且红色棒指示均值数值(n = 56-155 ;ns，不显著；*p〈0.05Tukey检验(关于完全统计学分析，见图6))。灰色的水平线指示10% hCD45+细胞。(图1C)来自组(图6B)的一个代表性小鼠子集(图6C)的BM中的移入水平(n = 12-16 ;*ρ〈0.05Tukey检验;还可见图6D-6E)。(图1D)在将200，000个FL-⑶34+细胞肝内注射入非照射新生MISTRG小鼠中后3个月血液和BM中的h⑶45 +细胞移入的代表性流式细胞术分析。(图1E)如(图1D)中移植的MISTRG小鼠的血液和BM中的人⑶45+细胞移入水平(η = 16) ο在此情况中，显示了所有小鼠(包括血液h⑶45+〈10%的小鼠)的BM。
[0017]图2(包括图2A-2K)描绘了实验结果，其显示了 MISTRG小鼠支持淋巴样和非淋巴样组织中的有效髓样发生和维持。(图2A)在X射线预先条件化后通过肝内注射FL-⑶34+细胞作为新生儿移入的，指定接受者小鼠的血液中的人造血细胞(hCD45+)间的人髓样细胞(h⑶33+)百分比。每个符号代表一只小鼠个体，并且红色棒标示均值数值(η = 20-113 ;图7Α中显示了统计学分析)。(图2Β)相同小鼠中的人WBC组成(η = 20-113只小鼠/组；η = 8名人供体；误差棒标示SEM)。(图2C)指定接受者小鼠的非髓样组织中人髓样细胞(h⑶68+)的免疫组织学染色。黑色棒代表20 μπι，并且显示的图像代表每组分析的至少三只小鼠。(图2D和图2Ε)人单核细胞子集的代表性流式细胞术分析(图2D)和频率(图2Ε)，这是通过接受者小鼠的血液中的h⑶45+⑶33+细胞间⑶14和⑶16表达鉴定的(η = 8-12只小鼠/组；误差棒标示SEM)。(图2F和图2G)自MITRG接受者的BM分离并用LPS (图2F)或R848(图2G)体外刺激的人单核细胞的细胞因子生成(误差棒标示一式三份的SD ;代表3项独立实验)。(图2H)MITRG小鼠的血液中存在的人细胞对表达GFP的大肠杆菌的体外吞噬(η = 7)。(图21、2J、2K)用LPS (图1 ;90分钟，η = 15-18)处理的，或用单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)(图 2J ;第 2 天，η = 6-15)或流感 A/PR8H1N1 (图2Κ ;第3天，η = 3-5)感染的小鼠的血清中通过ELISA或肺中通过RT-PCR测量的体内细胞因子生成。(图2A、2J、2K)通过单因素AN0VA，接着Tukey事后检验计算的P值(*p〈0.05)；(图21)以1glO转化的数值通过非配对Student t检验计算的p值。
[0018]图3(包括图3A-3I)描绘了实验结果，其显示了 MISTRG小鼠有效支持人NK细胞的发生和功能。(图3A)移入NSG、MITRG、和MISTRG小鼠的肝中人IL-15和IL_15Ra mRNA表达的定量RT-PCR分析(η = 7-8 ;通过单因素ANOVA计算的ρ值；*，p〈0.05Tukey事后检验)。将表达相对于小鼠Hprt标准化。(图3B)自移入MITRG的骨髓纯化的人细胞群体中人IL-15和IL-15R a mRNA表达的定量RT-PCR分析(η = 4-5,误差棒标示SEM)。将表达相对于人HPRT标准化，并且相对于hCD14+hCD16_细胞显示。(图3C和图3D)移入NSG、MITRG、和MISTRG中人NK细胞(hNKp46+hCD3-)的代表性流式细胞术分析(对hCD45+mCD45-细胞门控，淋巴细胞门；接近有轮廓区域的数字标示细胞的百分比)(图3C)和绝对数或频率(图3D) (η = 8-16 ;通过单因素ANOVA计算的ρ值；*，p〈0.05Tukey事后检验)。(图3E)来自保持未处理或用脂质体包囊的氯膦酸盐处理连续3天以消减吞噬细胞的移入MISTRG小鼠的人肝NK(hNKp46+h⑶3_)和T细胞(h⑶3+，作为对照显示)的绝对数目(η = 8 ;通过未配对Student t检验计算的ρ值；ns，不显著)。(图3F)以1:1比率1.V.注射经标记的LCL721.221 (HLA I类阴性