)和LCL721.45 (I类阳性)细胞，并且使用12小时后在脾中回收的经标记的细胞间HLA I类阳性或阴性的比例计算特异性NK细胞细胞毒性(η = 8，通过未配对Student t检验计算的ρ值)。(图3G)在利斯特氏菌感染后2天NSG和MISTRG小鼠的肝中人IFNymRNA表达的定量RT-PCR分析(η = 8_9，通过未配对Student t检验计算的P值)。将表达相对于小鼠Hprt标准化。(图3H和图31)来自未感染的或经利斯特氏菌感染的NSG和MISTRG小鼠的IFNy表达和脱粒(⑶107a+)人肝NK细胞的代表性流式细胞术分析(图3H)和频率(图31) (η = 4-11 ;通过单因素ANOVA计算的ρ值)。结果是自2项(图3Α、3Ε-3Ι)、3项(图3Β)、或4项(图3C、3D)实验组合的。
[0019]图4(包括图4A-4F)描绘了实验结果，其显示了 MISTRG中的人髓样细胞浸润肿瘤，并且支持其生长。在移入或非移入NSG和MISTRG小鼠的体侧中植入人黑素瘤细胞系Me290。用VEGF抑制剂Avastin?处理一些小鼠。在11天后测量并解剖肿瘤以进行分析。
(图4A)肿瘤中人造血细胞的浸润，其通过编码人造血(PTPRC，编码⑶45)和髓样(ITGAM，编码⑶Ilb)标志物的mRNA的表达来测定(η = 6-7 ;通过非配对Student t检验计算的ρ值)。(图4Β和图4D)来自NSG、MISTRG和患者的肿瘤中人髓样细胞标志物的代表性免疫组织化学照片。(图4C)⑶163+细胞的密度的量化(η = 3份样品/组，3片计数的载玻片/样品)。(图4Ε和图4F)指定小鼠组中的肿瘤的代表性照片(图4Ε)和体积(图4F) (η =7-24只小鼠/组)。通过Student t检验(图4A)或通过单因素ANOVA (图4C，4E)，接着通过Tukey事后检验计算ρ值Op〈0.05)。
[0020]图5描绘了髓样发生和HSC功能中牵涉的细胞因子。造血干细胞发育成髓样细胞的示意图和已知调节此过程的细胞因子的非穷举列表。阴影标示人和小鼠细胞因子之间的氨基酸同一性百分比。氨基酸同一性百分比是物种间蛋白质保守的最客观测量，但是它不总是与功能性物种间体内交叉反应性相关联。黑色矩形标示MISTRG中遗传人源化的细胞因子。HSC，造血干细胞；MPP，多能祖先；CMP，共同髓样祖先；GMP，粒细胞/巨噬细胞祖先；MEP,巨核细胞/红细胞祖先。
[0021]图6(包括图6A-6E)描绘了接受者小鼠中移入水平的统计学分析的结果。(图6A)图1A中呈现的数据(接受者小鼠的血液中hCD45+细胞的百分比)的统计学分析(单因素AN0VA，接着是Tukey事后检验；ns，不显著)。(图6B)在移植后7_9周达到血液中至少10% h⑶45+细胞的移入水平的接受者小鼠的数目。(图6C)图1C中用于BM分析的小鼠的血液移入水平。(图6D)图1C中呈现的数据(接受者小鼠的BM中hCD45+细胞的百分比)的统计学分析，类似于(图6A)。(图6E)图1C中显示的接受者小鼠的BM(2根股骨和2根胫骨)中hCD45+细胞的绝对数目。MISTRG的BM中的细胞数目减少是由于在该年龄(移植后10-12周)小鼠的尺寸较小，并且是由图10中详细描述的贫血的第一临床体征引起的。
[0022]图7(包括图7A-7H)描绘了实验结果，其评估MISTRG小鼠中增强的人髓样发生。(图7A)图2A中呈现的数据(接受者小鼠的血液中hCD33+细胞的百分比)的统计学分析(单因素AN0VA，接着是Tukey事后检验；ns，不显著)。(图7B和图7C)接受者小鼠的BM中人髓样细胞(hCD33+)的频率(图7B)和统计学分析(图7C)。(图7D)MISTRG的血液中人淋巴样和髓样谱系的代表性流式细胞术分析。(图7E和图7F)MISTRG和人供体的BM(图7E)和血液(图7F)中人单核细胞(CD33高SSC低CD660和粒细胞(CD33+SSC高CD66+)的代表性流式细胞术分析。(图7G和图7H)接受者小鼠的肺(图7G)和肝(图7H)中人髓样细胞(h⑶33+)的绝对数目(η = 8-12 ;通过单因素AN0VA，接着是Tukey事后检验计算的ρ值，*ρ〈0.05)。
[0023]图8(包括图8Α和8Β)描绘了实验结果，其显示了 MISTRG小鼠中增强的人单核细胞子集发生。(图8Α)人单核细胞子集的代表性流式细胞术分析，这是通过指定接受者小鼠的ΒΜ、脾、肺和肝中h⑶45+⑶33+细胞间⑶14和⑶16的表达鉴定的。(图8B)接受者小鼠的肺和肝中hCD33+细胞间的频率(误差棒代表SEM)和单核细胞子集的绝对数目(η = 12只小鼠/组；通过单因素ANOVA计算的ρ值；*，p〈0.05Tukey事后检验)。
[0024]图9(包括图9A和9B)描绘了实验结果，其显示了人单核细胞子集在MISTRG和人供体中是相似的。MISTRG接受者和人供体的血液(图9A)和BM(图9B)中指定人单核细胞子集延伸的免疫表型。显示了用同种型对照抗体和特异性抗体进行的染色。
[0025]图10 (包括图10A-10I)描绘了实验结果，其显示了人髓样细胞破坏人对小鼠吞噬耐受性。(图10A)将经CFSE标记的小鼠RBC转移入指定小鼠中，并且在指定时间点测量经标记细胞的频率。(图10B)用氯膦酸盐预先处理移入MISTRG以消减吞噬细胞或不然，并且转移并监测经CFSE标记的小鼠RBCJn (图10A)中的(ρ值，通过第1_3天的重复测量ANOVA测量的氯膦酸盐效果)。这些结果显示了转移的小鼠RBC在体内被MISTRG而非NSG中存在的吞噬细胞快速清除。(图10C)非移入小鼠(η = 9-15)或用人FL-CD34+细胞移入后8-10周(η= η-37)的血液中的RBC计数。ρ值指示每种基因型的非移入小鼠和移入小鼠之间的比较(Student非配对t检验)。(图10D)人移入水平(血液中h⑶45+细胞的百分比)和RBC计数之间的关联(n = 13-22)。(图10Ε)非移入或移入MISTRG的血液中小鼠(mTerll9+)和人(h⑶235a+)红系细胞的流式细胞术分析，其显示了移入MISTRG的血液中的几乎所有红系细胞是小鼠起源的，并且人红系细胞几乎不能检出。(图10F)指定品系的移入小鼠的代表性照片和脾重量(n = 3-22)，其显示了移入MISTRG小鼠中的脾大。使用来自Balb/c小鼠的脾作为对照(P值，单因素ANOVA ;*，p〈0.05，与所有其它组比较，Tukey事后检验)。(图10G)用H&E染色的移入NSG和MISTRG的脾的组织学切片，其显示了具有脾大的MISTRG小鼠中红髓的扩大。(图10H)小鼠红系祖先(mTerl19+mCD71+)的流式细胞术分析，其占移入MISTRG的脾中的细胞的多达80 %。(图101)非移入和移入MISTRG的血液涂片显示了网织红血球的富集。总之，这些结果强烈提示了 MISTRG中的贫血源自人对小鼠吞噬耐受性的缺失，并且大量的髓外小鼠红血球生成不能补偿对mRBC的破坏。结果代表每组(图10C，10E-10I)和2项独立实验(图10A，10B)中检查的至少5只小鼠。
[0026]图11 (包括图1lA和11B)描绘了实验结果，其显示了 MISTRG小鼠提供人IL-15/IL-15Ra ο (图 11A)移入 NSG、MITRG、和 MISTRG 小鼠的肺中人 IL-15 和 IL-15RamRNA 表达的定量RT-PCR分析(η = 7-8 ;通过单因素ANOVA计算的ρ值；*，p〈0.05Tukey事后检验)。将表达相对于小鼠Hprt标准化。(图11B)来自移入MISTRG小鼠的血液的人细胞群体(h⑶45+mCD45_)上IL_15Ra表达的流式细胞术分析(代表η = 4)。直方图分别代表用同种型对照或用IL-15Ra抗体进行的染色。结果代表两项实验或是自两项实验组合的。
[0027]图12 (包括图12A和12B)描绘了实验结果，其显示了 MISTRG小鼠中增强的人NK细胞发生。(图12A和图12B)移入NSG、MITRG、和MISTRG小鼠中人NK细胞(hNKp46+hCD:T)的频率(图12A)和绝对数目(图12B) (η = 8_16 ;通过单因素ANOVA计算的ρ值；*，p〈0.05Tukey事后检验)。结果是自4项实验组合的。
[0028]图13(包括图13A-13F)描绘了实验结果，其显示了展现出增强的成熟的真正人NK细胞存在于MISTRG小鼠中。(图13A)来自人供体和移入MISTRG的人血液NK细胞上的⑶94和⑶161表达的流式细胞术分析(η = 3)。直方图代表用同种型对照抗体或用⑶94/CD161抗体进行的染色。(图13Β)来自人供体或来自移入MISTRG小鼠的人血液NK细胞上的KIR表达的流式细胞术分析(η = 3)。数字指示KIR+细胞的频率。(图13C和图13D)来自移入NSG、MITRG、和MISTRG小鼠的人NK细胞上的CD16表面表达(η = 4-8 ;通过单因素ANOVA计算的ρ值;*，p〈0.05Tukey事后检验)。(图13E和图13F)来自移入NSG和MISTRG小鼠的人肝NK(hNKp46+h⑶3_)和T细胞(h⑶3+)的胞内穿孔蛋白表达(η = 3 ;通过非配对Student t检验计算的ρ值)。MFI，均值荧光强度。结果代表I项(图13A和图13B)、2项(图13E和图13F)、或4项(图13C和图13D)实验或是自I项(图13A和图13B)、2项(图13E和图13F)、或4项(图13C和图13D)实验组合的。
[0029]图14描绘了实验结果，其显示了人单核细胞/巨噬细胞消减对MISTRG小鼠中的人NK细胞稳态的影响。将移入MISTRG小鼠保持未处理或用脂质体包囊的氯膦酸盐处理连续3天以消减吞噬细胞。显示了肝(n = 8)中人单核细胞/巨噬细胞(上部小图，对h⑶33+细胞门控)和NK细胞(hNKp46+hCD3_)的流式细胞术分析。结果代表两项实验。在8只小鼠之I只中，单核细胞/巨噬细胞的氯膦酸盐消减并不是有效的，并且在该小鼠中没有观察到NK细胞数目减少。
[0030]图15描绘了实验结果，其显示了浸润黑素瘤的人髓样细胞的免疫组织化学。来自NSG、MISTRG或人患者的肿瘤中人髓样细胞的代表性免疫组织化学染色。显示了每组三名受试者和每位受试者3张照片。
[0031]图16显示了在具有单基因替换的接受者小鼠、NSG、MISTRG和人中移入水平和免疫细胞发生和功能的比较。
[0032]图17 (包括图17A-17D)描绘了实验结果，其表明了可以在MISTRG中移入自具有AML、CMML和MDS的患者分离的样品。(图17A)使用的样品的特征(包括疾病的类型和患者样品中找到的遗传异常)、实验方案(细胞纯化方法、每只小鼠注射的细胞数目和分析小鼠的移植后时间)和移入结果(包括具有可检测人移入的小鼠的数目，人造血CD45+细胞和髓样CD33+细胞的百分比，和自小鼠分离的人细胞中观察到的基因组异常)。(图17B)自移植RAEB I患者或正常供体细胞的小鼠分离的髓样CD33+细胞的颗粒性(SSC)的代表性流式细胞术分析，其显示了 RAEB I样品中有缺陷的颗粒性。(图17C)自移植RAEB II样品的小鼠分离的人细胞的代表性Fish分析，并且显示了染色体5q的缺失。(图17D)自移植CMML样品的小鼠分离的人细胞的核型，并且显示了染色体6中的删除。
[0033]发明详述
[0034]一般而言，本发明涉及经遗传修饰的非人动物，其表达人M-CSF、人IL-3、人GM-CSF、人SIRPA或人TPO中至少一种。本发明还涉及生成本文中描述的经遗传修饰的非人动物的方法和使用本文中描述的经遗传修饰的非人动物的方法。在一些实施方案中，经遗传修饰的非人动物是小鼠。在一些实施方案中，将人造血细胞移入本文中描述的经遗传修饰的非人动物。在各种实施方案中，移入有人造血细胞的本发明的经遗传修饰的非人动物可用于体内评估造血和免疫细胞的生长和分化，用于体内评估人造血，用于体内评估癌细胞，用于体内评估免疫应答，用于体内评估疫苗和疫苗接种方案，用于测试调控癌细胞生长或存活的药剂的效果，用于体内评估癌症的治疗，用于免疫介质(包括人抗体)的体内生成和收集，及用于测试调控造血和免疫细胞功能的药剂的效果。
[0035]定义
[0036]除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的含义。在各种标准参考文献中发现此类术语的例示性定义和使用，包括 J.Sambrook 和 D.W.Russell, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory Press,第 3 版，2001 ；F.M.Ausubel 编，Short Protocolsin Molecular B1logy, Current Protocols,第 5 片反,2002 ；B.Alberts 等,MolecularB1logy of the Cell,第 4 版，Garland,2002 ;D.L.Nelson 和 Μ.M.Cox, LehningerPrinciples of B1chemistry,第 4 片反，W.H.Freeman&Company, 2004 ; Jk.Herdewi jn, P.(编)，Oligonucleotide Synthesis:Methods and Applicat1ns, Methods in MolecularB1logy, Humana Press, 2004。虽然可以在本发明的实施或测试中使用与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料，但是描述了优选的方法和材料。
[0037]如本文中使用的，下述每项术语具有此部分中与其有关的意义。
[0038]冠词“一个”和“一种”在本文中用于指一个/种或超过一个/种(即至少一个/种)该冠词的语法对象。举例而言，“一个/种元件”意指一个/种元件或超过一个/种元件。
[0039]如本文中使用的，“约”在提及可测量的数值(诸如量、时间持续量等)时意图涵盖规定数值的± 20 %或± 10 %，更优选± 5 %，甚至更优选± I %，且仍更优选±0.1%的变化，因为此类变化对于实施公开的方法是合适的。
[0040]术语“异常的”在生物体、组织、细胞或其成分的背景中使用时指在至少一种可观察到的或可检出的特征(例如年龄、治疗、天数时间、等)上与那些展现“正常的”(预期的)相应特征的生物体、组织、细胞或其组分不同的那些生物体、组织、细胞或其组分。对于一种细胞或组织类型而言正常或预期的特征对于一种不同细胞或组织类型而言可能是异常的。
[0041]如本文中使用的，术语“抗体”指能够特异性结合抗原上的特定表位的免疫球蛋白分子。抗体可以是自天然来源或自重组来源衍生的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应性部分。本发明中的抗体可以以多种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、胞内抗体(“内抗体” (intrabody))、Fv、Fab和F(ab)2，以及单链抗体(scFv)、重链抗体(诸如骆蛇抗体)、和人源化抗体(Harlow等，1999，UsingAntibodies: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY ；Harlow 等，1989，Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York ；Houston 等，1988，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 85:5879-5883 ;Bird 等，1988，Science242:423-426)。
[0042]如本文中使用的，术语“癌症”定义为以异常细胞的不受控制的增殖和/或生长为特征的疾病。癌细胞可以局部扩散或经由血流和淋巴系统扩散至身体的其它部分。本文中的癌症包括实体瘤和造血恶性两者。适合于本发明的各种癌症的例子包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、骨癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、骨髓发育异常综合征(myeloidysplastic syndrome)、骨髓增殖性病症等等。
[0043]“组成性”表达是基因产物在细胞的大多数或所有生理条件下在活细胞中生成的状态。
[0044]基因的“编码区”由分别与通过基因转录生成的mRNA分子的编码区同源或互补的基因的编码链的核苷酸残基和基因的非编码链的核苷酸组成。
[0045]mRNA分子的“编码区”也由mRNA分子中与mRNA分子的翻译期间转运RNA分子的反密码子区匹配或编码终止密码子的核苷酸残基组成。如此，编码区可以包含构成不存在于由mRNA分子编码的成熟蛋白质中的氨基酸残基(例如蛋白质输出信号序列中的氨基酸残基)的密码子的核苷酸残基。
[0046]“疾病”指动物的一种健康状态，其中动物不能维持稳态，且其中如果疾病没有改善，那么动物的健康不断恶化。
[0047]比较而言，动物中的“病症”指动物能够维持稳态，但是动物的健康状态不及其没有病症时有利的健康状态。保持不处理，病症不必然引起动物健康状态的进一步降低。
[0048]如果疾病或病症的症状的严重性，患者经历此类症状的频率，或者这两者降低，那么疾病或病症是“减轻的”。
[0049]化合物的“有效量”或“治疗有效量”指足以对接受化合物施用的受试者提供有益效果的化合物量。投递媒介物的“有效量”指足以有效结合或投递化合物的量。
[0050]“编码”指多核苷酸(诸如基因、cDNA、或mRNA)中的特定序列核苷酸充当在生物学过程中合成其它聚合物和大分子的模板的固有特性，所述其它聚合物和大分子具有限定序列核苷酸(即rRNA、tRNA和mRNA)或限定序列氨基酸及源自其的生物学特性。如此，如果与基因对应的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物学系统中生成蛋白质，那么所述基因编码蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同，并且通常在序列表中提供)和非编码链(用作转录基因或cDNA的模板)两者可以称为编码蛋白质或所述基因或cDNA的其它产物。
[0051]如本文中使用的，“内源”指来自生物体、细胞、组织或系统内部或在生物体、细胞、组织或系统内部生成的任何材料。
[0052]如本文中使用的，术语“外源”指自生物体、细胞、组织或系统外部引入或在生物体、细胞、组织或