nger等,2011,Proceedings of the Nat1nal Academy of Sciences 108, 2390 ；Rongvaux等，2011，Proceedings of the Nat1nal Academy of Sciences 108, 2378)o
[0116]造血是一种受到紧密调节的发育过程，其中多能造血干细胞分化成更定型的祖先，然后分化成成熟的血液细胞(Kondo 等，2003，Annual review of immunology 21,759;Doulatov等，2012，Cell stem cell 10,120)。此过程需要支持连续发育步骤的特定细胞因子(图5)。多种人源化细胞因子间的协同可能会是在小鼠中完全重演人髓形成需要的。如此，生成了一种新颖的小鼠品系，称作MISTRG，其中编码M-CSF(Rathinam等，2011，Blood118，3119)、 IL-3/GM-CSF(Willinger 等，2011，Proceedings of the Nat1nal Academyof Sciences 108, 2390)和 TP0(Rongvaux 等，2011，Proceedings of the Nat1nalAcademy of Sciences 108, 2378)的基因在 hSIRPAtg RAG2 / IL-2Rγ 背景(Traggiai等，2004，Science 304， 104 ;Strowig 等，2011，Proceedings of the Nat1nal Academyof Sciences 108, 13218)中被其人对应物(Willinger 等，2011，Trends in immunology32, 321)替换。
[0117]遵循标准方案(Traggiai等，2004，Science 304，104)，以亚致死方式照射新生MISTRG小鼠及其同窝出生MITRG (缺乏hSIRPA转基因)，并移植人胎肝衍生的⑶34+细胞。共享相同的遗传背景但缺乏所有人源化等位基因的RAGZ+II^-Ry + O^G)小鼠和商品化NOD-Scid IL2-R γ + (NSG)小鼠充当对照。血液移入水平(h⑶45+细胞百分比；(图1A和IB ;和图6A))在RG中较低，而在NSG接受者中较高，如先前报告的(Strowig等,2011, Proceedings of the Nat1nal Academy of Sciences 108,13218 ；Brehm等，2010，Clinical immunology 135,84)。血液 hCD45+细胞的百分比在 MISTRG 中及在 NSG中是相似的。与RG相比，血液移入在MITRG中也显著增加，提示组合基因人源化克服对经由SIRP a /CD47交叉反应性诱导吞■细胞耐受性的需要(Strowig等，2011, Proceedings ofthe Nat1nal Academy of Sciences 108， 13218 ;Takenaka 等，2007，Nature immunology
8,1313 ；Legrand 等,2011,Proceedings of the Nat1nal Academy of Sciences108，13224)，这可能通过减弱小鼠先天性应答实现。选择在血液中具有至少10%人⑶45+细胞的小鼠进行进一步的实验(图6B)。在骨髓(BM)中，hCD45+细胞的百分比在大多数的这两种MISTRG接受者中超过90%并达到多至99% (图1A和IC ;及图6C至6E)，并且BM中的高移入效率不依赖于SIRP a /CD47相互作用。为了测试人源化细胞因子在更具竞争性的条件中支持人造血的能力，将人CD34+细胞移植入非照射MISTRG中。此方案在所有接受者的血液和BM中生成人⑶45+细胞(图1D和1Ε)，并且显著地，半数的小鼠显示出与在X射线预条件化后移入的接受者中测量到的最高水平一样高的嵌合性(比较图1E与图1B和1C)。本文中描述的数据显示了 MISTRG中多种细胞因子的遗传替换创建人造血能几乎完全置换骨髓中的小鼠造血的微环境，并且消除对病理学诱导性照射的需要。
[0118]接着，评估MISTRG小鼠支持人髓生成的能力。与RG和NSG相比，人髓样细胞(h⑶33+)在MISTRG的血液和骨髓中以显著更高的比例存在(图2A;和图7A至7C)。MISTRG中比例增加的髓样细胞导致血液组成类似于人血液的生理组成，其富含髓样细胞，并且根本上不同于富含淋巴样的小鼠血液的组成(Mestas和Hughes, 2004，Journal ofImmunology 172，2731 ;Rongvaux 等，2013，Annual review of immunology 31，6354)(图2B ;和图7D)。虽然单核细胞(CD33? SSC? CD660和粒细胞(CD33+SSC? CD66+)两者都存在于BM中(图7E)，但是外周血中的人髓样细胞群体主要由单核细胞构成(图7F)，提示人粒细胞的终末分化和自BM外出或外周存活在此小鼠环境中仍然是亚最佳的。然而，重要的是，人髓样细胞大量存在于MISTRG的非淋巴样组织，诸如肺、肝和结肠中，如通过免疫组织化学(hCD68+细胞;(图2C))或通过流式细胞术(hCD33 +;(图7G和7H))显示的，并且显著超过在NSG小鼠中找到的人髓样细胞数目约10倍。
[0119]在人中，已经基于⑶14和⑶16标志物的表达在表型和功能上描述了三种单核细胞子集(Auffray 等，2009，Annual review of immunology 27,669 ；Cros等，2010，Immunity 33，375)。人单核细胞的所有三种亚群(CD14+CD16-、CD14+CD16.和CD14dimCD16+)存在于MISTRG的淋巴样和非淋巴样组织(诸如肺和肝)中(图2D和2E ;及图8A和8B)。比较而言，在NSG中，在频率较低的髓样细胞外，仅能一致地检出⑶14+⑶16_和在一定程度上⑶14+⑶16+单核细胞，而⑶14 dimCD16+细胞仅被勉强呈现。MISTRG中找到的单核细胞亚群的延伸免疫表型(⑶33、⑶11b、⑶115、⑶62L和CX3CR1)与人外周血中的等同子集紧密相当(图9)。自MITRG的BM分离的人⑶14+⑶16—和⑶14 +⑶16+单核细胞响应TLR4和TLR7/8配体(分别为LPS和R848)生成高水平的炎性细胞因子(图2F和2G)。在对MITRG的WBC实施的体外测定法中，⑶14+⑶16_和⑶14 +CD16+细胞两者都具有较高的吞噬表达GFP的大肠杆菌的能力，而CD14dimCD16+单核细胞具有有限的吞噬细胞能力(图2H)，再次反映人血液中相应的亚群的生理学特性(Cros等，2010，Immunity 33，375)。在用LPS体内攻击或分别用细菌性和病毒性人病原体单核细胞增生利斯特氏菌和甲型流感感染时，MISTRG小鼠以人炎性细胞因子(分别为TNF a、IL-6和IFN γ )的稳健生成响应，而NSG小鼠显示显著更低(低约I个对数)的响应(图21至2Κ)。这些结果证明了 MISTRG中发生的人单核细胞子集在体外和在体内是功能性的。然而，小鼠中存在功能性人吞噬细胞的一个缺点是破坏人对小鼠吞噬细胞耐受性，小鼠RBC对所述吞噬细胞耐受性特别易感(图1OA和10Β)。这种对小鼠RBC的破坏导致贫血(图1OC至101)，并且将移入小鼠的寿命限于10-12 周(MISTRG)或 12-16 周(MITRG)。
[0120]髓样细胞能经由生成细胞因子来支持其它免疫细胞的发生和分化。评估MISTRG小鼠的髓样区室是否是人细胞因子(诸如IL-15)的来源。与此想法一致，发现了在与NSG比较时，人IL-15和IL-15Ra的mRNA表达在MISTRG中增加大于10倍(图3A;和图11A)。为了更为详细地限定MISTRG中人IL-15/IL-15Ra的细胞来源，测量纯化的人细胞群体中人IL-15和IL_15Ra转录物的丰度。人IL-15Ra mRNA的表达在人髓样细胞(hCD33+)中比在非髓样细胞(hCD33_)中更高(图3B)。特别地，CD14+CD16+单核细胞显示IL-15和IL-15Ra转录物两者的富集(图3B)。通过流式细胞术确认来自MISTRG的人髓样细胞的表面上人IL_15Ra蛋白质的表达(图11B)。
[0121]基于这些发现，评估MISTRG小鼠是否支持依赖于IL-15反式呈现的人免疫细胞(诸如 NK 细胞)的发生(Ma 等，2006，Annual review of immunology 24,657 ；Soderquest等，2011，Blood 117, 4511) o当前HHLS小鼠模型中人NK细胞的有效发生需要人IL-15/IL-15R α 的外源药理学投递(Huntington 等，2009，Journal of experimental medicine206，25 ;Chen等，2009，Proceedings of the Nat1nal Academy of Sciences 106, 21783 ；Pek等，2011，Immunob1logy 216，218) 23-25)，因为小鼠IL-15在体内不足以支持人NK细胞。如先前报告的(Huntington 等，2009，Journal of experimental medicine 206,25;Chen 等，2009，Proceedings of the Nat1nal Academy of Sciences 106, 21783 ；Pek等，2011，Immunob1logy 216，218)，在移入NSG 中观察到很少的人NK细胞(hNKp46+hCD:T)(图3C和3D ;及图12A和12B)。比较而言，人NK细胞在移入MISTRG的多种组织中容易检出，并且与NSG相比增加约10倍(图3C和3D ;及图12A和12B)。除了骨髓外，MITRG比MISTRG具有更少的人NK细胞，这最可能是由于先前报告的人NK细胞在外周中的存活对人SIRP α 的需求(Legrand 等，2011，Proceedings of the Nat1nal Academy of Sciences108，13224)。MISTRG小鼠中的hNKp46+hCD3_细胞代表真正的NK细胞，因为它们紧密模拟人对照表达典型的NK细胞表面标志物⑶94、⑶161、和杀伤抑制受体(KIR)(图12A和12B)。在其对发生的影响外，IL-15还促进NK细胞的成熟。一致地，发现了与NSG相比，成熟标志物CD16的表面表达和溶解性颗粒蛋白穿孔蛋白的量在来自MISTRG的NK细胞上更高(图13C 至 13F) ο
[0122]目前不知道人体内IL-15反式呈现的细胞来源，但是人髓样细胞能在体外支持人NK 细胞增殖(Huntington 等，2009，Journal of experimental medicine 206,25)。为了测试由人单核细胞/巨噬细胞进行的人IL-15反式呈现是否支持MISTRG中改善的人NK细胞发生，用脂质体包囊的氯膦酸盐(clodronate)处理小鼠以消减吞噬细胞(图14)。吞噬细胞的消减还诱导人NK细胞的显著减少(图3E)，提示人单核细胞/巨噬细胞的确是一种至关重要的细胞类型，其反式呈现IL-15以在体内支持人NK细胞稳态。
[0123]NK细胞通过杀死缺乏MHC I类表达的细胞(自失)(Raulet, 2006，Seminarsin immunology 18，145)，及通过生成关键的细胞因子 IFNy (Vivier 等，2008，Natureimmunology 9, 503)参与针对病原体的先天性防御。与较高的穿孔蛋白表达(图13E和13F) 一致，与NSG相比在MISTRG中在体内观察到显著增强的针对缺乏MHC I类的人细胞的NK细胞细胞毒性活性(图3F)。NK细胞是利斯特氏菌感染后的早期IFNy来源。因而，发现了肝中的人IFN γ mRNA表达在感染后2天在MISTRG中比在NSG中高超过10倍(图3G)。在单细胞分辨率上，来自经利斯特氏菌感染的MISTRG的NK细胞在没有离体再刺激的情况中以比在NSG(图31)中显著更高的频率显示了人IFNy的生成(图3H)。MISTRG中的NK细胞在利斯特氏菌感染后也具有溶解活性(脱粒)，如通过CD107a的质膜暴露显示的(图3H)。总体上，经由有效生成人髓样细胞得到的MISTRG支持人NK细胞的发生、分化、和功能，由此克服当前HHLS小鼠模型的一项主要限制。
[0124]接着，评估人髓样细胞在肿瘤微环境的背景中的作用。因此，使用人黑素瘤细胞系Me290 作为肿瘤模型(Valmori 等,1998, Journal of immunology 160, 1750)。临床观察显示了髓样细胞在数种实体瘤中浸润肿瘤，并且高密度的浸润性巨噬细胞与大多数类型的癌症中的不良患者预后有关(Qian 和 Pollard, 2010, Cell 141, 39 ；Coussens 等,Science339, 286 ;Egeblad等，2010, Developmental cell 18, 884 ;Nelson和Bissell, 2006, Annualreview of cell and developmental b1logy 22，287 ;Bingle 等，2002，T Journal ofpathology 196,254)。因而，在MISTRG中比在NSG中在肿瘤中检出更高的人髓样细胞浸润，如通过人PTPRC和ITGAM mRNA(分别编码CD45和CDllb)表达显示的(图4A)。极其类似患者中的人肿瘤，表达巨噬细胞标志物⑶163和⑶14的细胞在MISTRG中在肿瘤中是丰富的，但是在NSG中在相同肿瘤中几乎检测不到(图4B和4C;及图15)。大多数CD163+细胞也表达低水平的HLA-DR和高水平的⑶206 (图4B和4D)，即一种一般与“M2样”巨噬细胞有关的免疫表型(Hao 等，2012，Clinical&developmental immunology 2012, 948098 ；Tang, 2013, Cancer Lett 332,3)。
[0125]M2亚型的巨噬细胞经由多种效应器机制(包括对癌细胞的增殖信号、抗凋亡信号、促血管生成活性、实现癌细胞自原发性肿瘤外出和转移的形成)促进肿瘤进展(Qian 和 Pollard, 2010，Cell 141，39 ;Coussens 等，Science 339，286 ;Egeblad等，2010，Developmental cell 18,884)。评估肿瘤中的巨噬细胞浸润可以促进MISTRG中的肿瘤生长。显著地，观察到移入有⑶34+的MISTRG中的肿瘤(其在很大程度上被人⑶163+HLA_DRis⑶206+巨噬细胞浸润)的大小显著大于NSG中的肿瘤，其没有被人巨噬细胞浸润且是非移入NSG或MISTRG小鼠中看到的相同的较小尺寸(图4E和4F)。巨噬细胞支持肿瘤生长的机制之一是经由生成促进血管化和免疫抑制的细胞因子或酶。VEGF是一种重要的多功能性肿瘤支持性分子(Kandalaft等，Current topics in microb1logy andimmunology 344，129 ;Motz 和 Coukosj Immunity 39，61)，并且为了测试此因子是否牵涉MISTRG中的肿瘤生长，用人VEGF抑制剂Avastin?处理小鼠。此处理完全逆转肿瘤生长表型(图4F)，证明MISTRG中的髓样细胞经由VEGF依赖性机制支持黑素瘤生长。总体上，这些结果显示了 MISTRG小鼠重演人巨噬细胞在肿瘤发生中的作用，并且满足对如下模型的重要需求，所述模型容许体内研宄人肿瘤和人巨噬细胞之间的相互作用，尤其是在肿瘤发生开始时。
[0126]本文描述的数据已经证明了在MISTRG小鼠中提供多种人细胞因子导致对人造血和对人免疫细胞功能的直接或间接支持的协同影响(图16)。HHLS小鼠的MISTRG模型提供了体内研宄人先天性免疫应答的独特机会。
[0127]现在描述材料和方法。
[0128]小鼠品系
[0129]在RAGZ+yc+Balb/c x 129遗传背景中具有人SIRP α的BAC转基因表达或具有编码ΤΡ0、IL-3/GM-CSF和M-CSF的基因的敲入替换的小鼠的生成已有报告(Rathinam等，2011，Blood 118，3119 ;Willinger 等，2011，Proceedings of the Nat1nal Academyof Sciences 108, 2390 ；Rongvaux 等,2011, Proceedings of the Nat1nal Academyof Sciences 108，2378 ;Strowig 等，2011，Proceedings of the Nat1nal Academy ofSciences 108, 13218)。将这些品系杂交以获得 MITRG(M-CSFh/hIL-3/GM-CSFh/hTP0h/hRAG2+yc+)和 MISTRG (M-CSFh/hIL-3/GM_CSFh/hhSIRPAtgTP0h/hRAG2+γ c+)小鼠。那些小鼠是能活的，健康的且能育的。在无特定病原体的条件下在用饮用水中的恩氟沙星(enrofloxacin) (Baytril, 0.27mg/ml)连续处理的情况中维持小鼠。NOD Scidyc+(NSG)小鼠获自 Jackson Laboratory。
[0130]人HSPC制备和对接受者小鼠的移入
[0131]将人造血干细胞和祖细胞移入接受者小鼠，如描述的(Rathinam等，2011, Blood118, 3119 ；ffillinger 等,2011,Proceedings of the Nat1nal Academy of Sciences108, 2390 ；Rongvaux 等,2011, Proceedings of the Nat1nal Academy of Sciences108，2378 ;Traggiai 等，2004，Science 304， 104 ;Strowig 等，2011，Proceedings of theNat1nal Academy of Sciences 108，13218)。将胎儿肝样品切成小碎片，于37°C用胶原酶D (Roche, 100ng/mL)处理45分钟，并制备细胞悬浮液。通过