液体稳定的病毒疫苗的制作方法
【专利说明】液体稳定的病毒疫苗
[0001] 与相关申请的交叉引用 根据35U.S.C. § 119(e)，本申请要求于2012年8月21日提交的临时申请美国序列 号61/691，507 ;和于2013年3月12日提交的临时申请美国序列号61/777, 164的优先权， 所述临时申请的内容在此全文引入作为參考。 发明领域
[0002] 本发明涉及包含减毒活病毒的液体稳定疫苗。本发明还涉及此类疫苗的制造和对 动物对象进行疫苗接种的方法。
[0003] 发明背景 存在可以感染犬和/或猫的大量病毒。虽然由于相应的病毒，感染的症状例如可以包 括轻度感冒样症状，但其他可以是快速致命的，如犬瘟热病毒（CDV)感染的情况[參见例如 US2010/0196420]。事实上，⑶V触发可以涉及眼、呼吸道、胃肠道、皮肤和神经系统的多系 统感染。源于犬细小病毒（CPV)的死亡率也相当高[參见例如US2009/0010955]。CPV主 要是肠病原体，其感染犬，尤其是幼犬，并且特征在于在超过4至5周龄的犬和幼犬中的急 性腹泻、发热和白细胞減少症。甚至更年幼的犬可患有心肌疾病。犬瘟热病毒和犬细小病 毒是需要保护幼犬/犬不受其害的两种最重要的犬病毒。
[0004] 另外的犬病毒包括：犬副流感（CPI)病毒，其是引起促成上呼吸道疾病和传染性 气管支气管炎传染的呼吸系统疾病的高度传染性病毒；导致传染性肝炎的犬1型腺病毒 (CAVl);和高度传染性且可以引起严重类型的呼吸系统疾病的犬流感病毒（CIV)。已报道， CIV能够引起100%感染，伴随80%发病率，和在严重感染中高达5-8%的死亡率[Crawford 等人，Science310 (5747) :482-485 (2005) ;U.S. 7, 959,929B2]。
[0005] 类似地，存在困扰猫的许多猫病毒，包括猫杯状病毒（FCV)、猫白血病病毒 (FeLV)、猫泛白细胞减少症病毒（FPLV)、猫冠状病毒（FCoV)和猫鼻气管炎（FVR)病毒。
[0006] 目前广泛接受的是，预防由子犬或猫病毒感染的疾病的最佳方法是给它们接种针 对这些病毒的疫苗。事实上，犬瘟热病毒疫苗已显著降低相应疾病的流行。类似地，犬传染 性肝炎已被犬腺病毒-2疫苗（CAV2)极大限制。在疫苗中使用减毒的活CAV2代替紧密相 关的CAVl消除了关于下述的担忧，即在已用减毒的活CAVl接种的犬中观察到的间质性肾 炎和角膜混浊[Taguchi等人，6?/?Ke(プ 52 (9) :983 - 986 (2011)]。
[0007] 此外，可以安全地施用多价减毒活病毒疫苗，其限制需要的疫苗注射次数。相应 地，存在几种商购可得的多价减毒活病毒疫苗，其防御犬瘟热、犬传染性肝炎、犬细小病毒 和犬副流感病毒。另外，更新的多价疫苗还进ー步防御犬流感病毒。
[0008] 迄今为止，当贮存于液体溶液中时，减毒的犬和猫病毒一直不稳定。因此，在其长 期贮存前，大多数减毒的活犬或猫病毒疫苗是冻干的，即冷冻干燥的。减毒的活犬或猫病毒 通常作为在水中的悬浮液与保护剂混合，冷冻，并且随后通过在冻干过程期间的升华和二 次干燥脱水。冷冻和通过升华干燥的低温连同所涉及的低表面与体积比会需要长干燥时 期，并且因此显著増加制造时间和成本。
[0009]另外，在大型商业干燥过程中存在固有矛盾，这是因为：不能跨越整个产物负荷调 整货架温度，跨越干燥器的可变冷冻速度，边缘效应和辐射能效应。提高干燥温度以缩短干 燥时间通常不是可选的方案，因为干燥温度必须保持显著低于保护性蛋白质基质的玻璃转 化温度。此外，长的不一致的干燥时间和/或高干燥温度通常导致对减毒活病毒的结构性 损伤，连同其生物活性的显著丧失。
[0010] 因此，为了补偿功效的固有丧失，包含减毒活病毒的冻干的犬和/或猫疫苗以增 强的滴度贮存。然而，如果冻干过程实际上导致的活性丧失比预料的少，此类増加的滴度可 以导致显著的不利事件。因此，需要非常小心地配制疫苗，以使所包含的病毒滴度不仅安全 地低于导致不利事件的量，而且在考虑到由于冻干和后续贮存的病毒滴度丧失的情况下还 維持足够功效。因此，需要新的减毒的活犬和/或猫病毒疫苗，其可以使其病毒滴度可靠地 保持在安全和有效水平。
[0011] 本文任何參考文献的引用不应解释为承认此參考文献可用作本申请的"现有技 木'，。
[0012] 发明概述 为了克服现有疫苗的缺陷，本发明提供了新型液体稳定的减毒活病毒疫苗以及其相应 的免疫原性组合物。在某些实施方案中，所述减毒活病毒是减毒的活犬病毒。在其他实施 方案中，所述减毒活病毒是减毒的活猫病毒。本发明还提供了给动物施用此类疫苗的方法。 本发明进一歩提供了通过施用本发明的疫苗来预防动物中的疾病的方法。在具体实施方案 中，所述动物是犬科动物。在其他实施方案中，所述动物是猫科动物。
[0013] 相应地，本发明提供了包含减毒活病毒的液体稳定疫苗。在某些实施方案中，所述 减毒活病毒是重组病毒。在这种类型的具体实施方案中，将所述重组病毒作为编码异源蛋 白质的重组载体使用。在这种类型的更具体的实施方案中，所述异源蛋白质是病毒或细菌 抗原。
[0014]在具体实施方案中，所述疫苗包含糖添加剂和氨基酸。在这种类型的某些实施方 案中，所述疫苗包含10-30%糖添加剂。在具体实施方案中，所述疫苗包含12-27%糖添加 剂。在某些实施方案中，所述疫苗包含15-25%糖添加剂。在相关实施方案中，所述疫苗包 含15-20%糖添加剂。在其他实施方案中，所述疫苗包含20-25%糖添加剂。在更具体的实 施方案中，所述疫苗包含16-18%糖添加剂。在甚至更具体的实施方案中，所述疫苗包含17% 糖添加剤。
[0015]在本发明的液体稳定病毒疫苗的具体实施方案中，所述糖添加剂是蔗糖。在其他 实施方案中，所述糖添加剂是山梨糖醇。在另外其他实施方案中，所述糖添加剂是甘露醇。 在另外其他实施方案中，所述糖添加剂是海藻糖。在另外其他实施方案中，所述糖添加剂是 右旋糖。在具体实施方案中，所述糖添加剂实际上是两种或更多种糖添加剂的组合。在这 种类型的具体实施方案中，所述糖添加剂是蔗糖和山梨糖醇的组合。在这种类型的更具体 的实施方案中，所述糖添加剂是15%蔗糖和10%山梨糖醇的组合。
[0016] 本发明的液体稳定疫苗的pH范围可以为pH6.O-PH8.0。在某些实施方案中，所 述pH范围为pH6. 5-pH7.8。在具体实施方案中，所述pH范围为pH6. 8-pH7. 5。在更具 体的实施方案中，所述pH范围为pH7. 0-pH7.4。在甚至更具体的实施方案中，所述pH为 7. 2。
[0017] 本发明的液体稳定疫苗可以包含缓冲剂。在这种类型的具体实施方案中，所述缓 冲剂包含2. 5-50mMTris。在相关实施方案中，所述缓冲剂包含5-25mMTris。在具体 实施方案中，所述缓冲剂包含10-20mMTris。在另外其他实施方案中，所述缓冲剂可包含 2. 5-50mM组氨酸。在具体实施方案中，所述缓冲剂包含2. 5-50mMTris和2. 5-50mM组 氨酸。在更具体的实施方案中，所述缓冲剂包含5-25mMTris和5-25mM组氨酸。在仍更 具体的实施方案中，所述缓冲剂包含10-20mMTris和10-20mM组氨酸。在其他实施方案 中，所述缓冲剂包含2. 5-50mM磷酸盐。在相关实施方案中，所述缓冲剂包含5-25mM磷酸 盐。在具体实施方案中，所述缓冲剂包含10-20mM磷酸盐。
[0018] 本发明的液体稳定疫苗包含氨基酸。在某些实施方案中，所述氨基酸是精氨酸。在 其他实施方案中，所述氨基酸是甲硫氨酸。在另外其他实施方案中，所述氨基酸是甘氨酸。 在另外其他实施方案中，所述氨基酸是谷氨酸。在相关实施方案中，所述液体稳定疫苗包含 精氨酸和甲硫氨酸两者。在其他实施方案中，所述液体稳定疫苗包含精氨酸和甘氨酸两者。 在另外其他实施方案中，所述液体稳定疫苗包含甘氨酸和甲硫氨酸两者。在相关实施方案 中，所述液体稳定疫苗包含谷氨酸和甲硫氨酸两者。在其他实施方案中，所述液体稳定疫苗 包含谷氨酸和甘氨酸两者。在另外其他实施方案中，所述液体稳定疫苗包含谷氨酸和精氨 酸两者。在相关实施方案中，所述液体稳定疫苗包含精氨酸、谷氨酸和甲硫氨酸。在其他实 施方案中，所述液体稳定疫苗包含精氨酸、谷氨酸和甘氨酸。在另外其他实施方案中，所述 液体稳定疫苗包含精氨酸、谷氨酸和甲硫氨酸。在仍其他实施方案中，所述液体稳定疫苗包 含精氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸。在另外其他实施方案中，所述液体稳定疫苗包含精氨酸、甘 氨酸和甲硫氨酸。在具体实施方案中，所述液体稳定疫苗包含精氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸和 谷氨酸。
[0019] 在具体实施方案中，所述液体稳定疫苗中的精氨酸或谷氨酸或甘氨酸的最终浓度 为0.15-0. 6M。在相关实施方案中，所述液体稳定疫苗中的精氨酸或谷氨酸或甘氨酸的最 终浓度为〇. 2-0. 5M。在更具体的实施方案中，所述液体稳定疫苗中的精氨酸或谷氨酸或甘 氨酸的最终浓度为〇. 25-0. 35M。在甚至更具体的实施方案中，所述液体稳定疫苗中的精氨 酸或谷氨酸或甘氨酸的最终浓度为〇. 3M。
[0020] 在具体实施方案中，所述液体稳定疫苗中的精氨酸和/或谷氨酸和/或甘氨酸的 最终组合浓度为0.15-0. 6M。在相关实施方案中，所述液体稳定疫苗中的精氨酸和/或谷 氨酸和/或甘氨酸的最终组合浓度为〇. 2-0. 5M。在更具体的实施方案中，所述液体稳定疫 苗中的精氨酸和/或谷氨酸和/或甘氨酸的最终组合浓度为〇. 25-0. 35M。在甚至更具体 的实施方案中，所述液体稳定疫苗中的精氨酸和/或谷氨酸和/或甘氨酸的最终组合浓度 为 0? 3M0
[0021] 在具体实施方案中，所述液体稳定疫苗中的甲硫氨酸的最终浓度为0.025-0.3M。 在相关实施方案中，所述液体稳定疫苗中的甲硫氨酸的最终浓度为0.04-0. 15M。在更具体 的实施方案中，所述液体稳定疫苗中的甲硫氨酸的最终浓度为〇. 06-0. 09M。在甚至更具体 的实施方案中，所述液体稳定疫苗中的甲硫氨酸的最终浓度为〇. 07M。
[0022] 本发明的液体稳定疫苗还可以包含稳定剂蛋白质。所述稳定剂蛋白质可以是完整 蛋白质和/或蛋白质水解物。在具体实施方案中，所述稳定剂蛋白质是明胶。在更具体的 实施方案中，由本发明的液体稳定疫苗包含的稳定剂蛋白质是〇. 4-1. 6%明胶。在可选的实 施方案中，所述稳定剂蛋白质是完整酪蛋白的水解物。在这种类型的具体实施方案中，由 本发明的液体稳定疫苗包含的稳定剂蛋白质是稳定剂蛋白质是0. 5-2. 0%的完整酪蛋白的 水解物。在某些实施方案中，所述完整酪蛋白的水解物是完整酪蛋白的蛋白水解的水解物 (proteo