疗有效量的减毒活病毒与10-30%糖添加剂、氨基酸和pH6. 0-pH 8. 0的缓冲溶液，以形成液体稳定疫苗。所述氨基酸可以是精氨酸、甘氨酸、谷氨酸、甲硫氨 酸，或精氨酸、甘氨酸、谷氨酸和/或甲硫氨酸的组合。在具体实施方案中，精氨酸和/或甘 氨酸和/或谷氨酸在液体稳定疫苗中具有〇. 15-0. 6M的最终浓度。在某些实施方案中，甲 硫氨酸在液体稳定疫苗中具有0.025-0.3M的最终浓度。在具体实施方案中，所述减毒活 病毒的治疗有效量为减毒活犬病毒的治疗有效量。在这种类型的具体实施方案中，所述减 毒活犬病毒的治疗有效量包括减毒的活犬瘟热病毒、减毒的活犬2型腺病毒、减毒的活犬 细小病毒和减毒的活犬副流感病毒的治疗有效量。
[0040] 本发明的这些及其他方面通过參考下述详述将得到更佳理解。
[0041] 发明详述 与灭活的病毒疫苗相比，本发明的液体稳定的活病毒疫苗是减毒的。迄今为止，当配制 此类减毒活病毒疫苗时需要特别小心，以使减毒病毒的滴度維持在安全地低于可以导致显 著不良事件的水平。事实上，大多数减毒的活犬或猫病毒疫苗是冻干的，并且冻干可以由于 冻干过程本身以及在长期贮存期间随着时间的推移而导致减毒活病毒疫苗功效的大幅下 降。
[0042] 本发明已通过提供液体稳定疫苗来克服这个问题，所述液体稳定疫苗即使在贮存 期间也保持有效，而无需使减毒活病毒抗原的初始滴度増加超过可靠的安全水平。作为附 加益处，本发明通过显著減少制备此类安全且有效的疫苗所必需的减毒活病毒量，提供了 用于降低所提供的疫苗的制造成本的方法。另外，本发明的减毒活病毒疫苗比其冻干配对 物更便于使用。相应地，本发明提供了安全且有效的减毒活病毒疫苗，其可以作为液体在冷 藏温度贮存且仍保持稳定12-18个月或甚至更久。
[0043] 此外，令人惊讶的是，本发明的液体稳定的活病毒疫苗可以包括任何类型的犬和/ 或猫病毒。因此，本发明的液体稳定的活病毒疫苗可以包括有包膜和无包膜病毒两者。另 外，本发明的液体稳定的活病毒疫苗可以包括具有单链RNA基因组、单链DNA基因组或双链 DNA基因组的减毒活病毒。
[0044] 另外，本发明的液体稳定的活病毒疫苗还可以包括重组犬或猫载体，其为单独的 和/或连同其他此类重组载体、和/或连同减毒的活犬或猫病毒和/或与灭活的细菌和/ 或灭活的犬或猫病毒组合。此类重组犬或猫载体可以进ー步编码一种或多种异源病毒或细 菌抗原。此类重组载体的具体实例是重组犬副流感病毒5,其近来已由Li等人描述[プ o/ 87(10) 5985-5993(2013);在此全文引入作为參考]。
[0045] 本发明的液体稳定的活病毒疫苗的重组载体，例如重组副流感病毒5,可以编码来 自犬病毒、和/或猫病毒、和/或人病毒、和/或猿猴病毒、和/或牛病毒、和/或绵羊病毒、 和/或猪病毒、和/或家禽病毒（例如鸡病毒）的异源抗原。在具体实施方案中，本发明的 液体稳定的活病毒疫苗包含重组副流感病毒5,其编码来自ー种或多种鸡病毒的一种或多 种抗原。
[0046] 令人惊讶的是，在螯合剂（例如2mMEDTA)和/或佐剂（例如磷酸铝）的存在下， 即使在制剂中包括灭活的细菌时，本发明的液体稳定的活病毒疫苗也保持其稳定性（參见 下文实施例2)。相应地，本发明的液体稳定的活病毒疫苗可以进一歩包含一种或多种灭活 的犬或猫病毒和/或细菌（例如菌苗）和/或菌苗的亚级分。
[0047] 为了方便起见在说明书中使用的単数术语绝非期望受到如此的限制。因此，例如， 除非另有说明，提及"糖添加剤"包括提及此类糖添加剂中的ー种或多种。除非另有说明， 复数术语的使用也不期望是限制性的。类似地，除非另有说明，否则当在本文中指示为任ー 时，可以被称为酸或其相应碱的化学化合物意指该化合物的任一形式。因此，术语谷氨酸的 使用意欲包括谷氨酸盐，并且反之亦然。
[0048] 如本文使用的，"疫苗"是适合于应用于动物（在某些实施方案中，包括人）的组合 物，在施用于动物后，所述组合物诱导免疫应答，其強度足以最低限度地帮助防御起因于由 野生型微生物感染的临床疾病，即强度足以帮助预防临床疾病，和/或预防、改善或治愈临 床疾病。除非另有明确说明，否则术语疫苗的使用包括多价疫苗。
[0049] 如本文使用的，"多价疫苗"是包含两种或更多种不同抗原的疫苗。在这种类型的 具体实施方案中，所述多价疫苗刺激接受者的免疫系统预防两种或更多种不同病原体。
[0050] 如本文使用的，"液体稳定"疫苗是作为液体維持的疫苗（包括液体多价疫苗），当 贮存于或低于7°c(例如在标准冷藏库中，和/或在0°C-7°c下）时，所述疫苗保持有效至 少一年。在具体实施方案中，即使当贮存于或低于TC至少1. 5年时，所述液体稳定疫苗保 持有效。在更具体的实施方案中，即使当贮存于或低于TC至少2年时，所述液体稳定疫苗 保持有效。在仍更具体的实施方案中，即使当贮存于或低于TC至少2. 5-3年时，所述液体 稳定疫苗保持有效。
[0051] 如本文使用的，术语"保护"（"protect", "protecting")、"提供保护"（"provide protectionto"，''providingprotectionto〃）和''帮助 防御''（''aidsinthe protection")不要求免于任何感染指征的完全保护。例如，"帮助防御"可以意指保护是足 够的，从而使得在攻击后，潜在感染的症状至少被减少，和/或引起症状的潜在细胞、生理 学或生物化学原因或机制中的ー种或多种被減少和/或被消除。如本文中使用的，应当理 解"減少的"是指相对于感染状态，包括感染的分子状态，而不只是感染的生理学状态。
[0052] 如本文使用的，术语"治疗有效量"是给定抗原（例如减毒活病毒）的量，当在单 一施用中提供时和/或当预期，作为伴随一个或多个后续加强施用的初始施用提供时，所 述量足以提供保护和/或帮助防御施用该抗原以防御的病原体。
[0053] 如本文使用的，"有效"疫苗包含治疗有效量的给定抗原。
[0054] 如本文使用的，术语"药学可接受的"作为形容词使用，以意指被修饰的名词适合 于用于药物产品中。当它例如用于描述药物疫苗中的赋形剂吋，它将赋形剂表征为与组合 物的其他成分相容，并且不对预期接受者不利地有害。
[0055] 术语"载体"指与化合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。药学可接受 的载体可以是无菌液体，例如水和/或油，包括石油、动物、植物或合成起源的那些，例如花 生油、大豆油、矿物油、芝麻油等等。水或水溶液盐水溶液，和右旋糖和甘油的水溶液可以用 作载体，特别是用于可注射溶液。
[0056] 如本文使用的，"佐剂"是这样的物质，其能够有利于或放大免疫学事件级联，最终 导致更佳的免疫应答，即针对抗原的整合的身体应答。佐剂一般而言不是免疫应答发生所 需的，但有利于或放大该应答。
[0057] 如本文使用的，"全身施用"是施用到身体的循环系统（包含心血管和淋巴系统） 内，其影响作为整体的身体而不是特定部位，例如胃肠道（经由例如经ロ或直肠施用）和呼 吸系统（经由例如鼻内施用）。全身施用可以例如通过施用到肌肉系统内（肌内）、真皮内 (皮内、经皮或真皮上（supradermal))、皮肤下方（皮下）、粘膜下方（粘膜下）、静脉中（静 脉内）等来进行。
[0058] "肠胃外施用"包括皮下注射、粘膜下注射、静脉内注射、肌内注射、皮内注射和输 注。
[0059] 除非另有说明，如本文使用的，术语"犬/犬科动物"包括所有驯养犬、家犬 lupusfamiharis) {Camsfamiharis)〇
[0060] 犬细小病毒"CPV"在1978年被首次分离，并且命名为CPV-2,以使其与犬细小病毒 微小病毒（CMV或CPV-1)区分。在CPV-2最初分离后大约一年，鉴定出遗传变体CPV-2a。 在1980年代中期，鉴定出第二种遗传变体CPV-2b。CPV-2a和CPV-2b很快完全顶替CPV-2。 今天，在美国不再检测到CPV_2a[Parrish和Kawaoka，d/7/wTfeF.Microbiol.,59 ： 553-586 (2005)]。该家族中的第四种CPV变体，CPV-2c，在2000年首次得到描述[參见U.S. 8, 227, 593 ;U.S. 8, 258, 274;Hong等人，プVet.Diagn.Invest.(5) :535-9 (2007) ] 〇 于2013年12月19日提交的美国临时申请61/739, 067 (其内容在此全文引入作为參考）， 描述了特异性减毒的CPV-2c分离物（ATCC登录号PTA-13492)，其随后根据满足国际承认用 于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约要求的条件，于2013年1月24日保藏于美国典型 培养物中心（ATCC;10801UniversityBoulevard，Manassas，Va. 20110-2209，U.S.A.)。另 外，已构建了重组犬细小病毒，其包含异源CPV-2c/CPV-2基因组，即编码衣壳蛋白质的区 域来自CPV-2c分离物，且编码非结构蛋白质的区域来自CPV-2分离物[W02011107534 (Al); US20120328652 ;W02012007589(Al)，其内容在此全文引入作为參考]。如本文使用的，包 含"犬细小病毒"的本发明的疫苗可以包含这些CPV类型/变体/分离物中的ー种或多种， 包括近期构建的包含异源CPV-2c/CPV-2基因组的重组犬细小病毒。
[0061] 如本文使用的，术语"猫/猫科动物"指猫科的任何成员。该科的成员 包括野生、动物园和驯养成员，例如猫亚科的任何成员，例如猫、狮子、老虎、美 洲狮、美洲虎、豹、雪豹、黑豹、北美山狮、猎豹、猞猁、山猫、狞猫或其任何杂交种。猫还包括 驯养猫、纯种和/或杂种伴侶猫、展示猫、实验室猫、克隆猫和野生或野猫。
[0062] 如本文使用的，"糖添加剂"是5-12碳糖（例如蔗糖、麦芽糖、海藻糖、右旋糖、乳 糖、葡萄糖、果糖、半乳糖）或糖醇/多元醇（例如山梨糖醇、甘露糖醇、阿拉伯糖醇、肌醇、 麦芽糖醇）。除非另有具体相反说明，否则糖添加剂的百分比（%)作为疫苗中的糖添加剂的 重量（W)与疫苗体积（V)，（w/v)提供。
[0063] 除非另有具体相反说明，如本文使用的，疫苗中的固体添加剂（例如糖添加剂或 明胶）的百分比（%)是基于1%溶液，其为Ig固体/100ml疫苗体积（w/v)。
[0064] 除非另有具体相反说明，如本文使用的，疫苗中的液体添加剂（例如こ醇）的百分 比（%)是基于1%溶液，其为Iml液体添加剤/100ml疫苗体积（v/v)。
[0065] 除非另有具体相反说明，如本文使用的，提供的pH值是在25°C下測定/测量的