体感染 剂量（FAID50)。
[0088] 分析方法 び/效力:将病毒样品的稀释物接种到犬肾(DK)细胞上。在4-6天后，将单细胞层 固定且用焚光素缀合的CPI抗血清染色，并且通过Spearman-Karber方法计算病毒滴度 [Cunningnam,C.H.ALaboratorybuideinVirology，第/版，BurgessPublishingCo.， Minneapolis,MN. (1973) ；Kaplan,M.M.和Koprowski，H.，Laboratoryi'echniquesin Rabies,WorldHealthOrganization，Switzerland，（1973)]〇
[0089] 仰K激力:将病毒样品的稀释物接种到Vero细胞上。在5-7天后，就细胞病理效 应观察单细胞层，并且通过如上引用的Spearman-Karber方法计算病毒滴度。
[0090] 0激力:将病毒样品的稀释物接种到DK细胞上。在7天后，就细胞病理效应观 察单细胞层，并且通过如上引用的Spearman-Karber方法计算病毒滴度。
[0091] びK激力:将病毒样品的稀释物接种到DK细胞上。在3天后，用荧光素缀合的CPV 抗血清染色单细胞层，并且通过如上引用的Spearman-Karber方法计算病毒滴度。
[0092] 结果 左激rア游方仍:乾稳庐/##グ试:对于液体制剂筛诜已讲行两个研究。第一个研宄包括制 剂L-001至L-008,并且第二个研宄包括制剂L-009至L-026。（关于制剂细节參见表1)。 以ImL/小瓶/剂贮存在密封玻璃安瓿小瓶中的液体样品，在25°C或4°C下贮存后的不同 时间点进行测试。对于25°C贮存样品，关于⑶V、CAV2和CPI的稳定性数据显示于表2中。 因为液体CPV被视为四种病毒中最稳定的级分，没有就25°C贮存对CPV进行测试。对于在 25°C下温育的研究1样品（L-001至L-008)，将第0天、第6周和第8周数据用于比较不同 制剂。对于在25°C下温育的研究2样品（L-009至L-026)，将第0天、第6周和第12周数 据用于制剂筛选。已经测试了在两者之间的另外时间点，并且趋势是相似的。基于降解趋 势，每种制剂的相对稳定性如表2中所示手工分级，其中五个" + "是最稳定的，并且ー个" + " 是最不稳定的。每个病毒级分单独地分级，并且随后总体分级考虑了所有3种病毒。基于 分级和比较，观察到许多趋势。相应地，在测试的三种糖（蔗糖、山梨糖醇和甘油）中，蔗糖 和山梨糖醇的稳定性贡献明显优于甘油。还存在对于更高浓度糖的強烈优选，其中17%_25% 组合的糖表现优于具有小于10%的制剂。在来自蛋白质或氨基酸的稳定剂中，0. 3ML-精氨 酸具有最高稳定性贡献，随后为1%甲硫氨酸、〇. 8%明胶和1%NZ胺。在其他稳定剂中，右旋 糖酐硫酸酯和自由基清除剂（FRS)看起来促成液体CPV、CDV、CAV2和CPI制剂的稳定性，并 且尽管它们的存在没有显著改变稳定性概况，但它们对稳定剂也没有负面作用。因此，在某 些情况下，优选在最终制剂中包括右旋糖酐硫酸酯和/或FRS，用于液体活猫或犬病毒疫苗 在25°C下的长期贮存稳定性。另ー方面，发现TWEEN80和TWEEN20对于病毒制剂的稳定 性是有害的。
[0093] 在4V下实时稳宙件测试沒、)為靜龜啦活CPV、CDV、CAV2和CPI疫苗在4°C下的长 期贮存稳定性，并且数据呈现于表3中。对于L-001至L-008由在第12个月和第18个月 时的数据点，并且对于L-009至L-026由在第6个月和第12个月时的数据点外推出在4°C 下在24个月时的所研究的病毒滴度（參见下表3)。在期满时关于每种病毒的最低限度剂 量滴度要求在下表3的底部列出，并且用于测定何种制剂可以提供在4°C下稳定的产品。存 在高度可能产生稳定产品的十种制剂（L-009、L-011、L-012、L-014、L-15、L-016、L-018、 L-019、L-025和L-026)，而制剂L-003和L-007具有极大的潜力产生在4°C下具有2年贮 存期限的稳定产品。在检查的四种病毒中，CDV看起来是最不稳定的。对于CAV2、CPV和 CPI，所有十种制剂看起来能够提供在〇_8°C下超过3年的稳定性，并且对于CDV能够提供在 0-8°C下至少2年的稳定性。
【主权项】
1. 一种液体稳定疫苗，其包含减毒的活犬或猫病毒、10-30% (w/v)糖添加剂，和氨基 酸；其中所述液体稳定疫苗具有6. 0-8. 0的pH ;并且其中所述氨基酸选自精氨酸和甲硫氨 酸；其中当所述氨基酸为精氨酸时，它在所述液体稳定疫苗中的最终浓度为〇. 15-0. 6 M ; 并且其中当所述氨基酸为甲硫氨酸时，它在所述液体稳定疫苗中的最终浓度为0. 025-0. 3 M〇
2. 权利要求1的液体稳定疫苗，其中所述减毒的活犬病毒选自犬瘟热病毒、犬2型腺病 毒、犬细小病毒和犬副流感病毒。
3. 权利要求2的液体稳定疫苗，其中所述犬副流感病毒（CPV)选自CPV-2、CPV-2a、 CPV-2b、CPV-2c和包含异源CPV-2c/CPV-2基因组的重组CPV。
4. 权利要求1-3的液体稳定疫苗，其进一步包含0. 4-1. 6% (w/v)明胶。
5. 权利要求1-4的液体稳定疫苗，其进一步包含0.5-2. 0% (w/v)的完整酪蛋白的蛋白 水解的水解物。
6. 权利要求1-5的液体稳定疫苗，其进一步包含0. 25-1. 0% (v/v)乙醇。
7. 权利要求1-6的液体稳定疫苗，其进一步包含50-200剛EDTA。
8. 权利要求1-7的液体稳定疫苗，其进一步包含缓冲剂。
9. 权利要求8的液体稳定疫苗，其中所述缓冲剂包含2. 5-50 mM Tris。
10. 权利要求9的液体稳定疫苗，其中所述缓冲剂进一步包含2. 5-50 mM组氨酸。
11. 权利要求1-10的液体稳定疫苗，其中所述糖添加剂选自蔗糖、山梨糖醇，以及蔗糖 和山梨糖醇的组合。
12. 权利要求2或4-11的液体稳定疫苗，其中所述减毒活病毒是犬瘟热病毒。
13. 权利要求2或4-12的液体稳定疫苗，其包含减毒的活犬细小病毒（CPV)。
14. 权利要求13的液体稳定疫苗，其中所述CPV选自CPV-2、CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c 和包含异源CPV-2c/CPV-2基因组的重组CPV。
15. 权利要求14的液体稳定疫苗，其中所述CPV是CPV-2b。
16. 权利要求14的液体稳定疫苗，其中所述CPV是CPV-2c。
17. 权利要求16的液体稳定疫苗，其中所述CPV-2c具有ATCC登录号PTA-13492。
18. 权利要求2或4-17的液体稳定疫苗，其包含减毒的活犬2型腺病毒。
19. 权利要求2或4-18的液体稳定疫苗，其包含减毒的活犬副流感病毒。
20. 权利要求19的液体稳定疫苗，其中所述犬副流感病毒是编码且表达异源抗原的重 组载体。
21. 权利要求20的液体稳定疫苗，其中所述异源抗原是家禽病毒抗原。
22. 权利要求1-6或8-21的液体稳定疫苗，其进一步包含螯合剂。
23. 权利要求22的液体稳定疫苗，其中所述螯合剂选自乙二胺四乙酸（EDTA)、1，2-双 (邻氨基苯氧基）乙烷-N，N，N'，N' -四乙酸（BAPTA)、乙二醇四乙酸（EGTA)、二巯基琥珀酸 (DMSA)、和二亚乙基三胺五乙酸（DTPA)、2, 3-二巯基-1-丙磺酸（DMPS)。
24. 权利要求23的液体稳定疫苗，其中所述螯合剂为0. 5-5mM EDTA。
25. 权利要求1-24的液体稳定疫苗，其进一步包含佐剂。
26. 权利要求25的液体稳定疫苗，其中所述佐剂选自磷酸铝、氢氧化铝、可以在溶液中 形成交联以变成高分子量凝胶的低分子量共聚物佐剂，以及由在水中的丙烯酸钠的凝胶颗 粒构成的佐剂。
27. 权利要求1-26的液体稳定疫苗，其中所述疫苗进一步包含灭活的病毒。
28. 权利要求27的液体稳定疫苗，其中所述灭活的病毒选自犬流感病毒、犬肺病毒、犬 冠状病毒，或其任何组合。
29. 权利要求1-28的液体稳定疫苗，其中所述疫苗进一步包含灭活的细菌。
30. 权利要求29的液体稳定疫苗，其中所述灭活的细菌选自支气管炎博德特菌、支原 体属物种、犬埃立克体、无浆体属物种、犬钩端螺旋体、感冒伤寒型钩端螺旋体、哈德焦钩端 螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体、波摩那钩端螺旋体、问号钩端螺旋体、秋令热钩端螺旋体、 布拉迪斯拉发钩端螺旋体，或其任何组合。
31. 权利要求30的液体稳定疫苗，其中所述灭活的细菌包含犬钩端螺旋体、感冒伤寒 型钩端螺旋体、波摩那钩端螺旋体和黄疸出血型钩端螺旋体的组合。
32. 权利要求1-31的液体稳定疫苗，其中所述疫苗进一步包含抗生素。
33. -种针对下述中的至少一种对犬科动物进行疫苗接种的方法，其包括给所述犬科 动物施用权利要求1-32的液体稳定疫苗：犬瘟热病毒、犬2型腺病毒、犬细小病毒和犬副流 感病毒。
34. 权利要求33的方法，其中所述施用通过皮下注射进行。
35. -种制备权利要求1-32的液体稳定疫苗的方法，其包括将治疗有效量的减毒的活 犬或猫病毒与10-30% (w/v)糖添加剂、氨基酸和pH 6. 0-pH 8. 0的缓冲溶液组合，以形成 液体稳定疫苗； 其中所述氨基酸选自精氨酸和甲硫氨酸；其中当所述氨基酸为精氨酸时，它在所述液 体稳定疫苗中的最终浓度为〇. 15-0. 6 M ;并且其中当所述氨基酸为甲硫氨酸时，它在所述 液体稳定疫苗中的最终浓度为0.025-0. 3 M。
【专利摘要】本发明公开了包含减毒活病毒、10-30%糖添加剂和氨基酸的液体稳定疫苗。本发明还公开了此类疫苗的制造和通过施用此类疫苗保护动物的方法。PTA-1349220130124
【IPC分类】A61K39-175, A61K39-235, A61K39-23, A61K39-145, A61K39-295
【公开号】CN104640566
【申请号】CN201380044404
【发明人】K.奧康內尔, 乔志松
【申请人】英特维特国际股份有限公司
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2013年8月16日
【公告号】CA2879733A1, EP2887957A1, US20140056942, US20150246114, WO2014029702A1