一种基于适配体靶向递送microRNA的纳米载体及其制备方法与应用
【技术领域】：
[0001] 本发明属于纳米材料生物学领域。本发明涉及一种具革El向性的负载microRNA的 纳米载体及其制备方法，具体涉及一种MUC-I革El向性鱼精蛋白修饰的纳米金刚石载体的制 备方法及其在肺癌治疗中的应用。
【背景技术】：
[0002] MicroRNA (miRNA)是一类内源性非编码RNA，长度为20-25个碱基之间。MicroRNA 通过与mRNA的3'-非编码区（3'-UTR)结合，形成局部碱基配对以抑制mRNA的翻译或使其 降解。一种microRNA可以与mRNA的多个位点结合，一种基因的表达结果也可能被不同的 microRNA所调节。许多microRNA在不同癌症中表达异常，提示microRNA与癌症的发生发 展密切相关。不同的MicroRNA在癌症中扮演着不同的角色，有一些microRNA具有类似癌 基因的作用，在一些癌症细胞中表达较高，能够通过负向调控肿瘤抑制基因或通过调控细 胞周期、分化、凋亡过程，刺激细胞增殖，促进肿瘤内部血管生成，这些致癌性microRNA被 称为oncomirs ;而另一类microRNA则扮演着强有力的抑癌基因的角色，被称作抑癌miRNA。
[0003] 越来越多的miRNA被应用到癌症治疗中，但是仍然存在重要的问题，就是如何保 证这些无基因特异性的miRNA进入肿瘤细胞发挥治疗效果的效率。因此，为miRNA寻找优 秀的具有靶向效应的稳定载体是更好地发挥miRNA疗效的捷径。目前治疗癌症最常用且有 效的方法仍是联合化疗放疗法，但这种方法不可避免地会对人体造成伤害。因此，能够递送 特定抗肿瘤药物的新型载体越来越受到青睐。这些药物载体可以弥补药物的局限性，控制 药物在体内的释放速率，并且可降低药物对非肿瘤细胞的作用以避免细胞毒性的产生。纳 米金刚石是一种碳纳米材料，使用纳米金刚石作为microRNA载体治疗癌症，具有毒性低， 生物相容性高，能够延长被载药物在肿瘤部位的停滞时长等。
[0004] 核酸适配体（Aptamer)是一类具有特异性结合祀标分子、核酸或蛋白质的单链 DNA或RNA。纳米材料载体经化学修饰后可以进一步与核酸适配体结合，将靶向治疗效率大 大地提高。经纳米载体负载的核酸适配体极大地降低其免疫原性，不易被生物体降解，提高 自身负载治疗药物或分子的富集性，增强治疗效果。
【发明内容】
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[0005] 本发明为一种适配体革El向递送microRNA的纳米载体制备方法及应用。具体地说， 本发明以鱼精蛋白修饰的纳米金刚石载体，以核酸适配体-microRNA嵌合体（Apt-miR)作 为功能性负载物祀向治疗肺癌，该复合载体（核酸适配体-microRNA-纳米金刚石）制备快 捷方便，细胞毒性低，靶向治疗效果良好。
[0006] -种具祀向性的负载microRNA的纳米载体，其特征在于，所述载体为经过鱼精蛋 白硫酸盐修饰的纳米金刚石，该载体为阳离子性。
[0007] 进一步，其中纳米金刚石是通过爆炸法产生。
[0008] 进一步，鱼精蛋白硫酸盐来源于鲑鱼。
[0009] 进一步，其中单个纳米金刚石粒径为4-6nm，平均动力学尺寸为40-60nm，表面 zeta 电位为 13_18mV。
[0010] 进一步，其中所述的 microRNA 为 Hsa_miR-34a。
[0011] 进一步，靶向性分子为巯基修饰的MUC-I分子。
[0012] 制备纳米金刚石-MUC-1-miR-34a嵌合体复合纳米载体AMNPs的方法，其特征在于 包括以下步骤：
[0013] (1)将150mg/mL的纳米金刚石凝胶溶液溶于去离子水中，稀释为终浓度lmg/mL ; 在100W功率下过夜超声反应稀释后的ND溶液；
[0014] (2)将50mg鱼精蛋白硫酸盐溶于5mL去离子水中，使鱼精蛋白硫酸盐溶液终浓度 为 10mg/mL ;
[0015] (3)将纳米金刚石凝胶溶液与鱼精蛋白硫酸盐溶液按质量比1:15混合成为NPs溶 液，37 °C孵育48小时进行自组装反应；
[0016] (4) 48小时后，将NPs混合液12000rpm离心15分钟；弃上清液，得到的NPs小球 使用去离子水重新分散，再次离心沉淀洗涤，重复这一步骤三次；最后将沉淀冻干并溶于去 离子水，调整浓度为〇. 6mg/mL ;
[0017] (5)将SPDP修饰的miR-34a mimics溶解于ImL无 RNA酶水中，得到浓度为80 μ g/ mL RNA的溶液，按照质量比1: 4RNA的溶液与NPs溶液混合，室温孵育30分钟使其进行组装 反应得到MNPs ;
[0018] (6)按MUC-I :miR-34a摩尔比为1:2的比例将巯基修饰的MUC-I分子与MNPs过夜 孵育，组装成AMNPs。
[0019] 进一步，其中步骤（5)将SPDP修饰的miR-34a mimics具体为：将I. 25nmol5'端带 有氨基的miR-34a mimics溶于200 μ L PBS中得到miR-34a稀释液，同时按SPDP:miR-34a 摩尔比为1:20将0. 0625nmol SPDP交联剂溶于20 μ L DMSO得到SPDP工作液，将miR-34a 稀释液与SPDP工作液混合，孵育2小时。反应后，过量的SPDP通过超滤离心管多次离心分 离出去。
[0020] 上述方法制备的AMNPs。
[0021] 上述方法制备的AMNPs作为肺癌治疗药物中的应用。
[0022] 首先，本发明使用经过鱼精蛋白硫酸盐（Protamine sulfate，PS)修饰的纳米金刚 石碳纳米材料（Nanodiamond，ND)作为microRNA的输送载体（NPs)，其优点是细胞转染效 率高，可以快速高效地被细胞吸收。其次，利用Mucin-1 (MUC-I)核酸适配体作为目标配体， 设计合成一段长约25base的脱氧核苷酸单链结构，与microRNA-34a(miR-34a)形成嵌合体 结构，负载于NPs之上，以增加其递送至肺癌的革El向性，从而增强microRNA的治疗效率。
[0023] 鱼精蛋白是一种主要来源于鱼类的碱性蛋白质，具有较高的热稳定性，同时表现 出抑菌特性和生物活性。水溶性的鱼精蛋白硫酸盐通过氢键、表面电荷作用，能够吸附于纳 米金刚石表面；纳米金刚石是一种碳纳米材料，与其它纳米材料相比具有毒性小，生物相容 性较好等特点，其表面富集大量的羟基、羧基、羰基易与鱼精蛋白中的氨基结合，形成鱼精 蛋白包裹纳米金刚石的纳米颗粒，经此修饰后，NPs表面带有正电荷，能够吸附带有负电的 microRNA〇
[0024] Mucinl粘蛋白（MUC-I)是一种细胞表面糖蛋白，属I型跨膜蛋白，在正常情况下 多表达于各器官组织的上皮细胞中。这种糖蛋白在许多种类的肿瘤包括非小细胞肺癌细胞 表面都是表达高于正常水平的。由于MUC-I核酸适配体和miR-34a都是核苷酸，因此可以 经SPDP交联剂修饰后形成嵌合体；STOP (3-(2-吡啶二巯基）丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯） 能够与化合物上的氨基反应生成稳定的酰胺键，同时分子中的α -吡啶基对巯基敏感，发 生巯基-二硫基交换反应生成新的二硫键。在适当的条件下这两种反应同时进行而互不干 扰。这种交联方法副反应少，结合物产率高。
[0025] 由于纳米金刚石微粒在水溶液中成簇存在，所以使用前需要被超声振动分散。但 是这种分散仍不能够将纳米金刚石微粒分为单独个体，仍是以小簇型式存在，经过ZETA电 位表征可知其表面zeta电位为15mV左右，稳定状态下直径约为52nm左右，而单一纳米颗 粒理论直径为4nm左右。成团存在的纳米金刚石能够增加 microRNA的负载量，这也是使用 纳米金刚石作为载体的优势之一。
【附图说明】
[0026] 图1为NPs、MNPs、AMNPs自组装模型图；
[0027] 图2为MNPs与AMNPs复合物的表面zeta电位；
[0028] 图3A为琼脂糖甲醛变性胶电泳图之一。
[0029] 图3B为琼脂糖甲醛变性胶电泳图之二。
[0030] 其中1号泳道为MUC-lAptamer，2号泳道为miR-34a，3号泳道为MUC-I和miR-34a 的混合物，4号