泳道为MUC-1-miR-34a嵌合体；
[0031] 图4为激光共聚焦显微镜下观察AMNPs与MNPs被A549细胞摄取的能力。其中 miR-34a被红色荧光染料Cy-3标记，红色光强度与miR-34a的量成正比；
[0032] 图 5 为分别转染 miR-34a mimics (Naked miR-34a)、NPs、MNPs 与 AMNPs 后，A549 细胞中miR-34a的表达水平；
[0033] 图6为Transwell显微镜下观察结果和直方图结果显不miR_34a能够抑制A549 细胞迀移；
[0034] 图7为流式细胞仪检测结果显示miR_34a能够诱导非小细胞肺癌细胞凋亡。
【具体实施方式】
[0035] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0036] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0037] 实施例1纳米金刚石工作液的制备
[0038] 本发明中使用的纳米金刚石为凝胶溶液（15% w/v)，购自NanoCarbon Research Institute Ltd.(产品目录号：386-8567)，粒径为 3. 6±0.7nm。
[0039] 使用之前，将150mg/mL的纳米金刚石（Nanodiamond，ND)凝胶溶液溶于去离子水 中，稀释为终浓度lmg/mL。在100W功率下过夜超声反应稀释后的ND溶液。
[0040] 实施例2鱼精蛋白硫酸盐修饰纳米金刚石（NPs)
[0041] 本发明中使用的鱼精蛋白硫酸盐购自Sigma Adrich公司（产品目录号：PS4020)。
[0042] 将50mg鱼精蛋白硫酸盐（Protamine sulfate，PS)溶于5mL去离子水中，使鱼精 蛋白硫酸盐溶液终浓度为10mg/mL。将纳米金刚石凝胶溶液与鱼精蛋白硫酸盐溶液按质量 比1:15混合成为NPs溶液，37°C孵育48小时进行自组装反应。
[0043] 48小时后，将混合液12000rpm离心15分钟。弃上清液，得到的NPs小球使用去离 子水重新分散，再次离心沉淀洗涤，重复这一步骤三次。最后将沉淀冻干并溶于去离子水， 调整浓度为0. 6mg/mL。
[0044] 实施例3 SPDP交联剂修饰miR-34a
[0045] 本发明中使用的miR-34a mimics由广州锐博生物技术公司合成，其序列为，正义 链：5' -UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3' ；反义链：5' -ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3'，本发 明中使用的 Nsuccinimidyl-3-(2-pyridyldithio) propionate (SPDP)购自 Thermo-Fisher Scientific公司（产品目录号：21857)。
[0046] 按摩尔浓度1:20将SPDP cross-linker交联剂溶于DMSO中孵育2小时，同时将 I. 25nmol 5'端带有氨基的miR-34a mimics溶于200 yL PBS中。反应后，过量的SPDP使 膜超滤离心管多次离心分离出去。
[0047] 实施例 4 MiR-34a-NPs (MNPs)的制备
[0048] 将SPDP修饰的miR-34a mimics溶解于ImL无RNA酶水中，得到浓度为80 μ g/ mL RNA的溶液，按照质量比1:4与PNs溶液混合，室温孵育30分钟使其进行组装反应得到 MNPs 〇
[0049] 实施例 5 Aptamer-miR_34a-NPs (AMNPs)的制备
[0050] 为了将黏蛋白MUC-I (Mucin-I)适配体（MUC-IAptamer)连接到MNPs上组成 MUC-IAptamer-MNPs共轭体（AMNPs)，我们将MUC-I巯基化修饰，然后按miR-34a:MUC-l以 2:1的比例与MNPs过夜孵育形成miR-34a_aptamer嵌合体，组装成AMNPs。
[0051] 实施例6 NPs，MNPs和AMNPs粒径、表面电位的检测
[0052] 将合成的NPs，MNPs和AMNPs孵育15min后分别稀释成60 μ g/ml的浓度，通过 Zetasizer Nano ZS (Malvern, Worcestershire, IL K.)测试复合物的粒径和表面zeta 电位。 测试粒径的参数为25°C，90°散射角。表面电位的测定是基于纳米粒子在溶液中的电泳迀 移率，在自动模式下测定。
[0053] 自组装形成的NPs、MNPs、AMNPs模型图NPs如图1所示，其中，MNPs、AMNPs 的电位测定结果如图2所示。可以看出，在MNPs的基础上，将负载物由miR-34a更换 为miR-34a-MUC-l嵌合体，组装为AMNPs后，其复合物粒径由186. 7nm (± 5nm)增加至 190. lnm(±3nm);表面 zeta 电位由-20. 7mV(±l. 2mV)改变为-25. 6mV(±2. 3mV)。此结果 能够很好地证明带有负电的MUC-IAptamer成功地连接到了 MNPs系统中。
[0054] 实施例7凝胶电泳检测Aptamer-miR-34a嵌合体的连接
[0055] 制备琼脂糖甲醛变性胶（2%，100ml)，称重3g低熔点琼脂糖粉末溶解于适量DEPC 水中，煮沸直至完全溶解，再加入适量的DEPC水定容至93ml。溶液冷却至60°C左右后，加 入30ml 5XM0PS-EDTA Buffer和27ml 37%甲醛（在通风橱中操作），倒胶后于室温静置 1小时。
[0056] 取 15 μ I miR_34a mimics，MUC-IAptamer 和 AMPNs 与 5 μ I RNA loading buffer (+EB)混合，100V (恒压）条件下电泳至溴酷蓝迀移至胶的2/3左右位置，使用Alpha Innotech凝胶成像系统观察结果并拍照。
[0057] 电泳结果如图3, A所示，琼脂糖凝胶电泳图表示左数第一条miR_34a条带能够清 晰地显示在琼脂糖凝胶上；而第二条MNPs条带，由于miR-34a被NPs所吸附，其总体电荷被 减弱，因此无法在琼脂糖凝胶上移动；第三条MNPs+SDS条带表示在MNPs与SDS混合之后， SDS破坏了 MNPs的结构，使miR-34a脱离出来并显示出电泳条带。图3，B中的1，2, 3,4号 条带分别代表MUC-IAptamer，miR-34a，MUC-I 和 miR-34a 的混合物，MUC-1-miR-34a 嵌合体， 由电泳结果可以看出，按本发明中的方法，MUC-I与miR-34a能够很好地形成嵌合体结构。
[0058] 实施例8 AMPNs摄取能力的检验
[0059] 1、细胞培养及接种
[0060] 本发明使用非小细胞肺癌细胞系A549做为细胞实验对象，A549购自购自中国科 学院细胞库。将获得的细胞悬液离心后重悬于5mL PBS溶液中，使用血球计数板计数后，取 IX 105个细胞置入含有15mL预热的DMEM培养基中。培养基事前已混合进10%的胎牛血 清和1 %链霉素-青霉素双抗，整个操作与无菌操作台内进行。将培养基置入无菌孵育箱， 37°C，5 % C02条件下培养，至细胞汇合至90 %后传代或冻存。
[0061] 2、材料的转染
[0062] 使用新配制的AMNPs转染细胞，同时配制对照组MNPs，将制备好的AMNPs、MNPs与 Opti-MEM培养基按比例混合，使得miR-34a的终浓度为ΙΟΟηΜ。除去培养皿中的培养液， 使用PBS清洗细胞3遍，加入上述稀释好的混合液lmL，未经处理的A549细胞作为对照组， 37°C孵育6小时。6小时后，去除各培养皿中的液体，加入预热37°C的含10% FBS的DMEM 培养基，37°C继续培养18小时。
[0063] 3、共聚焦显微镜检测
[0064] 转染好的细胞经过固定、染色处理后方可使用激光共聚焦显微镜观察。除去培养 皿中的培养基，加入ImL 4%多聚甲醛固定液进行固定30分钟。然后向固定好的细胞中加 入ImL Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚），以溶解细胞膜表面脂质，使后续染料进入细 胞。室温孵育10分钟后，加入ImL