提前配制好的5% (w/v)BSA封闭液，继续在室温下封闭 1小时。最后加入500 μ L DAPI染色液，室温避光孵育3分钟进行染色。除去染色液，使用 PBS清洗培养皿5次以去除过多染色液对视野的干扰。激光共聚焦显微镜观察细胞：设置 激发波长为570nm，发射波长660nm观察红色Cy-3焚光标记。
[0065] 结果如图4所示，AMNPs组中Cy-3荧光强度远高于MNPs组，说明由于MUC-I的靶 向作用，使整个纳米载体系统更高效地被A549细胞所摄取，其靶向效果明显。在放大图中 可以看到，Cy-3标记的miR-34a能够进入细胞并富集在细胞核（蓝色）周围。
[0066] 实施例 9 Real-time PCR 检测 miR-34a 的表达
[0067] 1、检测前准备
[0068] 按照实施例8中的方法，使用新配制的AMNPs转染细胞，同时配制对照组 MNPs。然后使用Trizol法提取各组细胞的总RNA，并使用NCode? VILOTM miRNA cDNA Synthesis (产品目录号MIRC-50, Life Technologies)试剂盒将其反转录为cDNA，准备检 测其中microRNA的表达量。
[0069] 2、RT-PCR 检测 miR-34a 的表达
[0070] 本发明使用 Ncode? EXPRESS SYBRk GreenER? miRNA qRT-PCR 试剂盒（产品目 录号A11193_051，Life Technologies)检测miR_34a的表达水平。首先需要设计Forward 引物，具体设计原则参照试剂盒使用手册。
[0071] RT-PCR结果如图5所示，MNPs与AMNPs转染A549细胞后，其miR-34a表达水平高 于对照组。此外，由于AMNPs的靶向性，AMNPs转染组中miR-34a的表达量具有明显上升效 果。
[0072] 实施例10 Transwell实验检测A549细胞转移能力
[0073] 按照实施例8中的方法，使用新配制的AMNPs转染细胞，同时配制对照组MNPs。待 转染细胞生长融合至60 %至70 %时更换为无血清DMEM培养基饥饿培养24小时。24小时 后，消化细胞并更换为无血清培养基，调整细胞数量为IX IO5个/100 μ L，将细胞悬液吹打 均匀，每个Transwell小室中加入100 μ L细胞悬液，小室外围加入含10% FBS的DMEM培养 基500 μ L作为诱导物，每组设3个重复孔。培养8小时后，使用4%多聚甲醛固定细胞，并 使用0. 2%结晶紫溶液颜色。将小室浸泡在干净的PBS中并于显微镜下观察，对于每个小 室，显微镜下取8个随机视野拍照并计数。
[0074] 结果如图6所示，A为正常培养的Α549细胞作为对照；B为NPs转染的Α549细胞； C为MNPs转染的Α549细胞；D为AMNPs转染的Α549细胞；E为直方图表示的细胞相对迀移 能力。可以看出，MNPs和AMNPs将miR-34a运送至Α549细胞后不同程度地抑制了细胞的 迀移，但AMNPs组显示出更加明显的细胞迀移抑制能力。
[0075] 实施例11 Annexin V-PI检测细胞凋亡
[0076] 为了检测MiR_34a是否具有降低A549细胞耐凋亡的能力，本研宄使用流式细胞仪 检测Annexin V-FITC/PI (碘化丙啶）双染法染色的细胞凋亡情况。碘化丙啶是一种双链 DNA荧光染料，荧光强度与双链DNA的含量成正比。碘化丙啶能够通过透过凋亡中晚期细胞 膜通透性加强的细胞，将细胞核染成红色。Annexin V是一种磷脂结合蛋白，能够通过细胞 外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期的细胞膜结合。因此将Annexin V与PI配合使用可 以将晚期凋亡细胞与坏死细胞同时被FITC和PI结合染色呈双阳性（Annexin V+/PI+)。
[0077] 结果如图7所示，miR-34a能够引发A549细胞凋亡。A为正常培养的A549细胞作 为对照；B为NPs转染的A549细胞；C为MNPs转染的A549细胞；D为AMNPs转染的A549细 胞；E为直方图表示的细胞凋亡百分比。结果显示AMNPs组能够明显引发细胞早期凋亡。
【主权项】
1. 一种具革G向性的负载microRNA的纳米载体，其特征在于，所述载体为经过鱼精蛋白 硫酸盐修饰的纳米金刚石，该载体为阳离子性。
2. 根据权利要求1所述的载体，其中纳米金刚石是通过爆炸法产生。
3. 根据权利要求1所述的载体，鱼精蛋白硫酸盐来源于鲑鱼。
4. 根据权利要求1所述的载体，其中单个纳米金刚石粒径为4-6nm，平均动力学尺寸为 40_60nm，表面zeta电位为 13_18mV。
5. 根据权利要求1所述的具革El向性的负载microRNA的纳米载体，其中所述的 microRNA为Hsa_miR-34a〇
6. 根据权利要求1所述的microRNA革El向性输送载体，革El向性分子为疏基修饰的MUC-I 分子。
7. 制备纳米金刚石-MUC-l-miR-34a嵌合体复合纳米载体AMNPs的方法，其特征在于包 括以下步骤： (1) 将150mg/mL的纳米金刚石凝胶溶液溶于去离子水中，稀释为终浓度lmg/mL;在 IOOW功率下过夜超声反应稀释后的ND溶液； (2) 将50mg鱼精蛋白硫酸盐溶于5mL去离子水中，使鱼精蛋白硫酸盐溶液终浓度为 lOmg/mL； (3) 将纳米金刚石凝胶溶液与鱼精蛋白硫酸盐溶液按质量比1:15混合成为NPs溶液， 37 °C孵育48小时进行自组装反应； ⑷48小时后，将NPs混合液12000rpm离心15分钟；弃上清液，得到的NPs小球使用 去离子水重新分散，再次离心沉淀洗涤，重复这一步骤三次；最后将沉淀冻干并溶于去离子 水，调整浓度为0. 6mg/mL; (5) 将SPDP修饰的miR-34amimics溶解于ImL无RNA酶水中，得到浓度为80yg/mL RNA的溶液，按照质量比1:4RNA的溶液与NPs溶液混合，室温孵育30分钟使其进行组装反 应得到MNPs; (6) 按MUC-I:miR-34a摩尔比为1:2的比例将巯基修饰的MUC-I分子与MNPs过夜孵 育，组装成AMNPs。
8. 如权利要求7所述的方法，其中步骤（5)将SPDP修饰的miR-34amimics具体为：将 1.25]11]1〇15'端带有氨基的11111?-343 111；[111；[〇8溶于 200 1^1^?133中得到11111?-343稀释液，同时 按SPDP:miR-34a摩尔比为1:20将0. 0625nmolSPDP交联剂溶于20yLDMSO得到SPDP工 作液，将miR-34a稀释液与SPDP工作液混合，孵育2小时。反应后，过量的SPDP通过超滤 离心管多次离心分离出去。
9. 如权利要求7或8所述的方法制备的AMNPs。
10. 如权利要求7或8所述的方法制备的AMNPs作为肺癌治疗药物中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种基于适配体靶向递送microRNA的纳米载体及其制备方法与应用。其中靶向分子为巯基修饰的MUC-1分子，可与抑癌性microRNA-34a结合，使MicroRNA-纳米金刚石-鱼精蛋白复合体(MNPs)成为具有主动靶向功能的AMNPs。通过静电相互作用，将带负电荷的aptamer-microRNA(Apt-miR)嵌合体吸附于阳离子性鱼精蛋白-纳米金刚石基载体，构成三元复合载体。进行纳米转运体系对非小细胞肺癌的治疗效果的研究。Apt-miR嵌合体免疫原性小，经修饰的MUC-1核酸适配体在生物体内化学稳定性好，并且易于化学合成。为提高其转染效率，使用鱼精蛋白修饰的纳米金刚石材料(NPs)帮助miRNA通过渗透和滞留增强效应增加其在肿瘤部位的积累。
【IPC分类】A61K47-42, A61K31-708, A61K48-00, A61P35-00, A61P11-00, A61K47-04, A61K47-26
【公开号】CN104784703
【申请号】CN201510188921
【发明人】张芳, 辛婧, 王怡慧, 邓雄威, 盛望
【申请人】北京工业大学
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年4月20日