结合有细胞质转导肽及聚乙二醇的干扰素α融合蛋白的制作方法
【专利说明】结合有细胞质转导肽及聚乙二醇的干扰素 α融合蛋白 【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞质转导肽（Cytoplasmic Transduction Peptide，CTP)和聚乙二 醇一同结合于干扰素-a (interferon-a，IFNa )蛋白质的干扰素-α融合蛋白。 【【背景技术】】
[0002] 干扰素用作肝炎治疗剂，并以干扰素-a制剂（Intron-A :Schering，Roferon-A : Roche)以及给药次数少于干扰素-a制剂的加入聚乙二醇的（PEGylated) IFN制剂 (PEG-Intron :Schering，Pegasys :Roche)等方式销售。
[0003] 作为干扰素-α治疗的初期副作用，具有发热、恶寒、全身无力、食欲不振、恶心 及肌肉痛等，且这种症状在几乎所有患者中以与给药容量成正比的方式出现，而这种症 状在治疗初期最为严重，只要中断治疗就会消失。并且，已知在肝炎患者中，PEG-干扰 素-α治疗中的副作用的频率和严重程度与干扰素-α治疗相似（Kwan Sik Lee, Dong Joon Kim et al.Management of Chronic Hepatitis B，The Korean Journal of Hepatology. 13:447-488,（2007))。
[0004] 如上所述，随着基于干扰素的给药容量的副作用的传播，在使用干扰素作为治疗 剂的过程中，为将副作用最小化需要减少给药量。
[0005] 以往，为了解决如上所述的问题而提出过将细胞质转导肽（cytoplasmic transduction p印tide，CTP)融合于干扰素，来改善干扰素的肝移动性，从而解决干扰素α 的治疗副作用的方法。但将上述融合蛋白向小鼠模型给药时，由于初期活性急剧减少，使得 活性在约6小时之后减少一半以上，因而改善融合蛋白的肝移动及残留特性的必要性随之 出现。
[0006] 本说明书全文中，参照了多篇专利文献，并表示了其引用。所引用的专利文献的公 开内容全部插入于本说明书作为参照，从而更加明确说明本发明所属的技术领域的水平及 本发明的内容。 【
【发明内容】
】
[0007] 【技术问题】
[0008] 本发明人致力于通过研发外源肽和聚乙二醇的结合之类的蛋白质变形，从而提高 现有的干扰素的药剂学功效的干扰素融合蛋白。结果，通过实验证明了若通过接头在 干扰素-α蛋白质的N末端结合细胞质转导肽，并通过接头在C末端结合聚乙二醇，则干扰 素的固有活性得到较高的维持，生物体内的半衰期得到延长，且肝的移动能力得到提高，从 而完成了本发明。
[0009] 因此，本发明的目的在于，提供干扰素-α融合蛋白，上述干扰素-α融合蛋白通 过改善以往的干扰素融合蛋白的肝移动及停留特性，最终能够期待干扰素给药量的减少。 [0010] 本发明的再一目的在于，提供对上述干扰素-α融合蛋白进行编码的核酸分子。
[0011] 本发明的另一目的在于，提供包含上述核酸分子的载体。
[0012] 本发明的还一目的在于，提供包含上述载体的转化子。
[0013] 本发明的又一目的在于，提供干扰素-α融合蛋白的制备方法。
[0014] 本发明的又一目的在于，提供肝脏疾病的预防或治疗用药剂学组合物。
[0015] 本发明的目的及优点借助以下的
【发明内容】
、发明要求保护范围及附图来更加明 确。
[0016] 【技术方案】
[0017] 根据本发明的一实施方式，本发明提供干扰素-α融合蛋白，由 CTP-X-IFN a -Y-PEG表示，上述干扰素-α融合蛋白的特征在于，上述CTP为细胞质转导肽 (cytoplasmic transduction peptide);上述 X 为由 1-10 个甘氨酸（glycine)组成的肽 键；上述Y为1-100个半胱氨酸、甘氨酸或由甘氨酸及半胱氨酸组成的肽键；上述IFNa为 干扰素 -a 2a或干扰素-a 2b ;上述PEG为聚乙二醇（polyethylene glycol)。
[0018] 本发明人致力于通过研发外源肽和聚乙二醇的结合之类的蛋白质变形，从而提高 现有的干扰素的药剂学功效的干扰素融合蛋白。通过本发明的一实施例，在向干扰 素-α蛋白质和CTP之间导入接头之后，选择不改变干扰素-α蛋白质的结构的接头，并在 上述融合蛋白的C-末端融合聚乙二醇之后，对此进行了活性分析。
[0019] 结果，通过实验确认了若通过接头在干扰素-α蛋白质的N-末端结合细胞质转导 肽，并通过接头在C-末端结合聚乙二醇，则干扰素的固有活性得到较高的维持，生物体内 的半衰期得到延长，且肝的移动能力得到提高。即，上述结果最初证明了通过接头将CTP及 PEG分别与干扰素α融合蛋白的N末端及C末端相连接，从而改善融合蛋白的生物体内的 移动及残留效果，并改善现有的PEG或连接PEG及CTP的融合蛋白的治疗效果。具体地，这 种效果通过以下方式实现：1)通过接头连接干扰素α蛋白质和CTP，从而使CTP的功能最 优化；2)通过聚乙二醇与干扰素α蛋白质的C末端相融合，从而延长生物体内的半衰期； 3)使线性（linear form)聚乙二醇与干扰素-α蛋白质的C末端相连接。
[0020] 在本说明书中所使用的上述术语"干扰素-a (IFNa)融合蛋白"意味着在干扰 素-α蛋白质仅结合CTP的蛋白质或同时结合CTP和PEG的蛋白质。在本说明书中，意味 着在干扰素-α蛋白质仅结合CTP的融合蛋白的情况下，还记载为"CTP-X-IFNa -Y"。
[0021] 在本说明书中所使用的术语"细胞质转导肽（CTP) "作为由本发明人最初导入的术 语，意味着既保留细胞膜渗透能力，又具有残留于细胞质的特性，即，意味着抑制向核内移 动的特性的肽。
[0022] 本发明的IFNa融合蛋白所包含的CTP作为由本发明人为了解决蛋白转导结构域 (PTD)的问题而世界上最初开发的递送肽（delivery p印tide)，对此进行了申请并得到了 专利注册（韩国特许第0608558号、美国专利第7101844及日本专利第4188909号），上述 专利文献所公开的与CTP相关的内容插入为本发明的内容。
[0023] 在本发明的IFNa融合蛋白所包含的CTP中，肽的长度相当于所属领域中接受的 一般长度，优选为9-20氨基酸，更优选为9-15氨基酸，最优选为11氨基酸。
[0024] 根据本发明的优选实施例，本发明的IFNa融合蛋白所包含的CTP包含选自由序 列表中序列1至序列表中序列14所公开的序列组成的组中的氨基酸序列。优选地，本发明 的CTP包含序列表中序列1的序列。
[0025] CTP具有优秀的细胞膜渗透能力，且具有在向细胞内导入之后，也抑制向核的 移动的特性，因而在生物体内，与其他递送体（尤其，蛋白转导结构域（PTD，protein transduction domain)或聚精氨酸（polyarginine))相比，细胞毒性低，且具有使融合的 蛋白质向肝移动的独特性质，因此是将肝作为靶的用于疾病治疗的有效的药物递送肽。
[0026] 在本说明书中所使用的术语"干扰素-a (IFNa ) "意味着用于抑制病毒的复制及 细胞增殖，并调节免疫反应的同质性佳、种特异性的蛋白质组。
[0027] 本发明的IFNa融合蛋白所包含的干扰素 -a (IFNa )为重组IFNa 2b、重组 IFNa 2a、重组IFNa 2c、作为天然a -干扰素的被纯化的混合物的IFNa-nl、复合a -干 扰素（参照美国专利第4897471号及第4695623号）或作为天然a -干扰素的混合物的 IFN a -n3,更优选为IFN a 2a或IFN a 2b，最优选为IFN a 2b。IFN a 2b的制备方法已详细记 载于美国专利第4, 530, 901号。
[0028] 根据本发明的优选实施例，本发明的IFNa融合蛋白所包含的IFNa包含序列表 中序列21所公开的氨基酸序列。
[0029] 在本发明的IFNa融合蛋白中，上述X为由1-10个甘氨酸（glycine)残基组成的 肽键。CTP通过上述肽键与IFNa的N-末端相结合。
[0030] 利用肽键X来连接CTP与IFNa之间，从而向CTP肽赋予柔韧性（flexibility) 和自由旋转（free rotation)能力，从而使CTP顺畅地执行原有的功能。
[0031] 并且，通过将结合有CTP的融合蛋白表达及纯化时因具有疏水性的CTP而发生的 融合蛋白的沉淀最小化，能够增大纯化收率。
[0032] 根据本发明的具体一实施例，在对CFNl蛋白质（CTP-IFNa )实施纯化的情况下， 发生了沉淀，但在与肽键相结合的CFN8蛋白质（CTP-GGGG-IFNa)的情况下，并未发生沉 淀。
[0033] 优选地，上述肽键X可以为1-10个甘氨酸残基，可优选为1-8个甘氨酸残基，更优 选为1-7个甘氨酸残基，尤其优选为1-5个甘氨酸残基，进而优选为3-5个甘氨酸残基，可 以为4个甘氨酸残基。
[0034] 在本发明的IFNa融合蛋白中，上述Y为1-100个半胱氨酸残基、甘氨酸残基或由 甘氨酸及半