0087] 图4以比较方式示出了本发明中IFNa融合蛋白401C及PEGASYS(罗氏公司 (Hoffman LaRoche Ltd.))的应用于猴子上的临床前药物动力学测定结果。实验所使用的 试样分别以300 μ g/kg体重的容量将PEGASYS和IFNa融合蛋白40IC进行了给药。第一 次将试样进行给药之后经6天的时间测定了活性。确认了本发明的IFNa融合蛋白401C 的IFN α活性高，且到第六天为止，维持比PEGASYS优秀或同等的活性。
[0088] 图5a及图5b示出了对本发明的融合蛋白和对照组药物的肝移动能力进行比较 的结果。示出了向小鼠将本发明的干扰素-α融合蛋白和对照组药物PEGASYS(罗氏公司 (Hoffman LaRoche Ltd.))进行给药之后，根据时间的推移分别测定血液（图5a)及肝（图 5b)中的抗-病毒活性的结果。 【【具体实施方式】】
[0089] 以下，通过实施例对本发明进行更加详细的说明。这些实施例只用于更加具体地 说明本发明，对于所属领域普通技术人员来说，根据本发明的要旨，本发明的范围不会因这 些实施例而受到限制是显而易见的。
[0090] 【实施例】
[0091] 【实施例I :CTP融合IFNa基因的聚合酶链反应（PCR，polymerase chain reaction)合成】
[0092] 向来源于人类的干扰素-a (Interferon-α，IFN α )的N-末端插入CTP肽，并向 CTP和IFN α之间插入了由4个或6个甘氨酸（glycine)组成的甘氨酸接头（linker)。通 过甘氨酸接头连接CTP和IFN α之间，向CTP肽提供柔韧性，从而不仅使其功能变得顺畅， 而且当实施纯化时，将起到由疏水性的CTP引起的沉淀最小化的作用。并且，通过聚合酶链 反应法向IFNa基因的C-末端插入半胱氨酸（cysteine)，与马来酰亚胺PEG(Maleimide PEG)的反应使PEG能够附着于C-末端。通过在C-末端附着线性PEG，能够大大提高体内 半衰期。
[0093] 首先，为了在附着于IFNa的N-末端的CTP肽和IFNa之间插入甘氨酸接头，使 用了以下表1所记载的引物来实施了聚合酶链反应。
[0094] 将IFNa作为模板，使用PR2引物和PR3引物来实施了第一次聚合酶链反应。将 所生成的聚合酶链反应产物重新作为模板，并使用PRl引物和PR2引物来实施了第二次 聚合酶链反应。由此，取得了由6个对肽CTP-GGGGGG-IFNa进行编码的核酸分子作为 最终产物，上述肽CTP-GGGGGG-IFNa与由6个甘氨酸组成的接头相连接。将最终产物 CTP-GGGGGG-IFNa蛋白质命名为CFN7(序列表中序列32)。
[0095] 将IFNa作为模板，使用PR2引物和PR4引物来实施了第一次聚合酶链反应。将 所生成的聚合酶链反应产物重新作为模板，并使用PRl引物和PR2引物来实施了第二次聚 合酶链反应。由此，取得了对CTP-GGGG-IFNa进行编码的核酸分子作为最终产物，上述 CTP-GGGG-IFNa与由6个甘氨酸组成的接头相连接。将上述最终产物CTP-GGGG-IFNa蛋 白质命名为CFN8 (序列表中序列33)。
[0096] 为了将丝氨酸蛋白酶分裂（hepsin cleavage)序列插入于附着在IFNa的N-末 端的CTP肽和IFNa之间，使用了以下表1所记载的引物来实施了聚合酶链反应。将 IFNa作为模板，使用PR2引物和PR5引物来实施了第一次聚合酶链反应。将所生成的 聚合酶链反应产物重新作为模板，并使用PRl引物和PR2引物来实施了第二次聚合酶 链反应。由此，取得了对肽CTP-KQLRVVNG-IFNa进行编码的核酸分子作为最终产物， 上述肽CTP-KQLRVVNG-IFNa与由丝氨酸蛋白酶分裂组成的接头相连接。将最终产物 CTP-KQLRVVNG-IFNa蛋白质命名为CFNll (序列表中序列34)。
[0097] 为了将甘氨酸和丝氨酸蛋白酶分裂序列一同插入于附着在IFNa的N-末端的 CTP肽和IFN a之间，使用了以下表1所记载的引物来实施了聚合酶链反应。将IFN a作 为模板，使用PR2引物和PR7引物来实施了第一次聚合酶链反应。将所生成的聚合酶链 反应产物重新作为模板，并使用PRl引物和PR2引物来实施了第二次聚合酶链反应。由 此，取得了对肽CTP-GGGGKQLRVVNGGGG-IFNa进行编码的核酸分子作为最终产物，上述肽 CTP-GGGGKQLRVVNGGGG-IFN a与由丝氨酸蛋白酶分裂和在上述丝氨酸蛋白酶分裂的左右分 别具有4个甘氨酸和3个甘氨酸的接头相连接。将最终产物CTP-GGGGKQLRVVNGGGG-IFN a 蛋白质命名为CFN12(序列表中序列35)。
[0098] 为了将甘氨酸和肝细胞生长因子激活剂（hepacyte growth factor activator) 一同插入于附着在IFNa的N-末端的CTP肽和IFNa之间，使用了以下表1所记载的引物 来实施了聚合酶链反应。将IFN a作为模板，使用PR2引物和PR8引物来实施了第一次聚合 酶链反应。将所生成的聚合酶链反应产物重新作为模板，并使用PRl引物和PR2引物来实施 了第二次聚合酶链反应。由此，取得了对肽CTP-AKTKQLRVVNGGGG-IFNa进行编码的核酸分 子作为最终产物，上述肽CTP-AKTKQLRVVNGGGG-IFN a与由肝细胞生长因子激活剂和3个甘 氨酸组成的接头相连接。将最终产物CTP-AKTKQLRVVNGGGG-IFNa蛋白质命名为CFN13(序 列表中序列36)。
[0099] 将制备的上述CFN7、CFN8、CFN11、CFN12及CFN13的结构呈现于图1中。
[0100]【表I】
【主权项】
1. 一种干扰素-a融合蛋白，由CTP-X-IFNa-Y-PEG表示，上述干扰素-a融合蛋白的 特征在于， 上述CTP为细胞质转导肽； 上述X为由1-10个甘氨酸组成的肽键； 上述Y为1-100个半胱氨酸、甘氨酸或由甘氨酸及半胱氨酸组成的肽键； 上述IFN a为干扰素-a 2a或干扰素-a 2b ; 上述PEG为聚乙二醇。
2. 根据权利要求1所述的干扰素_ a融合蛋白，其特征在于，上述CTP包含选自由序列 表中序列1至序列表中序列14所公开的序列组成的组中的氨基酸序列。
3. 根据权利要求1所述的干扰素_a融合蛋白，其特征在于，上述干扰素_a为干扰 素-a 2b 〇
4. 根据权利要求1所述的干扰素_a融合蛋白，其特征在于，上述干扰素_a包含序列 表中序列21所公开的氨基酸序列。
5. 根据权利要求1所述的干扰素-a融合蛋白，其特征在于，由上述"CTP-X-IFNa -Y" 表示的干扰素-a融合蛋白内的肽部分包含选自由序列表中序列15至序列表中序列20组 成的组中的一种氨基酸序列。
6. 根据权利要求1所述的干扰素_ a融合蛋白，其特征在于，上述聚乙二醇为线性聚乙 二醇。
7. 根据权利要求1所述的干扰素_ a融合蛋白，其特征在于，上述聚乙二醇的分子量为 20-60kDa〇
8. 根据权利要求1所述的干扰素-a融合蛋白，其特征在于，上述X为由1-5个甘氨酸 组成的肽键。
9. 根据权利要求1所述的干扰素_ a融合蛋白，其特征在于，上述Y为1-10个半胱氨 酸、甘氨酸或由甘氨酸及半胱氨酸组成的肽键。
10. -种核酸分子，其特征在于，对由上述权利要求1至9中的任一项所述的干扰 素-a融合蛋白内的"CTP-X-IFN a -Y"表示的肽部分进行编码。
11. 一种载体，其特征在于，包含上述权利要求10所述的核酸分子。
12. -种转化子，其特征在于，由上述权利要求11所述的载体转化而成。
13.-种肝脏疾病的预防或治疗用药剂学组合物，其特征在于，包含： (a) 权利要求1至9中的任一项所述的干扰素- a融合蛋白的药剂学有效率；以及 (b) 药剂学上允许的载体。
14. 根据权利要求13所述的肝脏疾病的预防或治疗用药剂学组合物，其特征在于，上 述肝脏疾病为肝癌或肝炎。
15. 根据权利要求14所述的肝脏疾病的预防或治疗用药剂学组合物，其特征在于，上 述肝炎为基于丙型肝炎病毒性肝炎的C型肝炎。
【专利摘要】本发明涉及在IFNα蛋白质结合有细胞质转导肽(CTP)和聚乙二醇(PEG)的IFN-α融合蛋白。本发明的IFN-α融合蛋白的干扰素的固有活性得到较高的维持，当向生物体给药时，半衰期得到延长，且肝的移动能力得到提高。本发明的IFN-α融合蛋白能够使用于对包括各种病毒性感染等的肝脏疾病的预防或治疗有效的蛋白质医药品的开发。
【IPC分类】A61K38-21, C07K19-00, A61P35-00, C12N15-62
【公开号】CN104583240
【申请号】CN201380043015
【发明人】裴容洙, 洪承镐, 金荣训, 韩承洙, 金真
【申请人】Jw可瑞基因株式会社
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2013年8月7日
【公告号】US20150202312, WO2014027789A1