、粘质沙雷氏菌及多种假单胞菌属之类的肠杆 菌科菌株等。
[0059] 并且，在使本发明的载体转化于真核细胞的情况下，可利用酵母（Saccharomyce cerevisiae)、昆虫细胞及人体细胞（例如，CHO(中国仓鼠卵巢，Chinese hamster ovary) 细胞株、W138、BHK、C0S-7、293、!fepG2、3T3、RIN及MDCK细胞株）等作为宿主细胞。
[0060] 将本发明的载体向宿主细胞内运输的方法在宿主细胞为原核细胞的情况下，可 利用 CaCl2方法（Cohen, S.N.et al·，Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114 (1973))、 单程方法（Cohen，S.N.et al.，Proc.Natl.Acac.Sci.USA，9:2110-2114(1973)及 Hanahan, D.，J. Mol. Biol.，166:557-580 (1983))及电穿孔法（Dower, W. J. et al.，Nucleic. Acids Res. ,16:6127-6145(1988))等来实施。并且，在宿主细胞为真核细胞的情况下， 可通过微注入法（Capecchi, M. R.，Cell, 22:479 (1980))、磷酸妈沉淀法（Graham, F. L. et al.，Virology, 52:456 (1973))、电穿孔法（Neumann, Ε· et al.，EMBO J.，1:841 (1982))、 脂质体介导的转染法（Wong, T. K. et al.，Gene, 10:87 (1980) )、DEAE-右旋糖酐治疗法 (Gopal，Mol.Cell Biol. ,5:1188-1190(1985))及基因轰击法（Yang et al.，Proc.Natl. Acad. Sci. ,87:9568-9572(1990))等来向宿主细胞内注入载体。
[0061] 向宿主细胞内注入的载体可在宿主细胞内进行表达，而在这种情况下，取得大量 的"CTP-X-IFNa -Y"。例如，在上述表达载体包含Iac启动子的情况下，利用IPTG对宿主细 胞进行处理，从而能够诱导基因的表达。
[0062] 以下，由于本发明的IFN-α融合蛋白的制备方法中包括了制备上述的本发明的 由"CTP-X-IFNa-Y"表示的肽的方法，因而两者之间的共同的内容为了避免因反复记载引 起的说明书的过度复杂性而省略记载。
[0063] 根据本发明的又一实施方式，本发明提供包括以下步骤的IFNa融合蛋白的制备 方法：步骤（a)，培养由表达载体转化而成的转化子，上述表达载体包含对由以操作性的方 式与启动子相连接的"CTP-X-IFNa-Y"表示的肽部分进行编码的核酸分子的步骤（b)，从 上述步骤（a)的转化子培养液中获得融合蛋白；以及步骤（c)，在从上述步骤（b)中获得的 融合蛋白的C-末端结合聚乙二醇（PEG)。
[0064] 本发明中的术语"启动子"意味着用于调节编码序列或功能性RNA的表达的DNA碱 基序列。
[0065] 在本说明书中，术语"以操作性的方式相连接"意味着核酸表达调节序列（例：启 动子、信号序列或转录调节因子结合位置的陈列）和其他核酸序列之间的功能性的结合， 由此，上述调节序列调节上述其他核酸序列的转录和/或转化。
[0066] 在本发明中，转化子的培养通过所属领域公知的通常的原核细胞或真核细胞的培 养方法来执行。例如，只要用于培养转化子的培养基包含能够使原核细胞或真核细胞有效 利用的碳源、氮源及无机盐等，就能均使用天然培养基或合成培养基。
[0067] 转化子的培养通常在振荡培养或基于旋转器的旋转的培养之类的有氧性条件下 执行。培养温度优选为15至50°C，培养时间通常为5小时至7天。优选地，培养基的pH在 培养过程中维持在3. 0至9. 0的范围内。培养基的pH可利用无机酸或有机酸、碱溶液、尿 素、碳酸钙、氨等来调节。若有需要，可在培养过程中添加氨苄西林、四环素之类的抗生素。
[0068] 从本发明中所培养的转化子的细胞中分离所表达的外源重组蛋白质的方法可使 用所属领域通常利用的蛋白质的分离及纯化方法来执行。例如，可使用基于利用硫酸铵或 PEG等的溶解度的分离（solubility fractionation)、基于分子量的超过滤分离、基于多种 色谱法（为了基于大小、电荷、疏水性或亲和性的分离而制备的）的分离等多种方法，通常 利用上述方法的组合来进行分离及纯化。
[0069] 根据本发明的又一实施方式，本发明提供肝脏疾病的预防或治疗用药剂学组合 物，其包含：(a)上述本发明的IFNa融合蛋白的药剂学有效率；以及（b)药剂学上接受的 载体。
[0070] 借助本发明的组合物来预防或治疗的肝脏疾病包括肝癌、肝炎、肝硬化及其他肝 脏疾病，优选地，包括肝癌及肝炎，例如，上述肝炎可以为急性病毒性肝炎、慢性肝炎及暴发 性肝功能衰竭等，更优选地，可以为B型肝炎或C型肝炎，最优选地，可以为基于丙型肝炎病 毒（HCV，Hepatitis C virus)性肝炎的C型肝炎。
[0071] 根据本发明的优选实施例，优选地，本发明的肝脏疾病治疗用药剂学组合物能够 以非口服方式进行给药，更优选地，能够向皮下进行给药。
[0072] 在本说明书中，术语"药剂学有效量"意味着实现上述本发明的融合蛋白的功效或 活性的足够量。
[0073] 本发明的药剂学组合物作为根据需要含有药剂学上接受的通常的无毒性载体、辅 助剂及赋形剂的容量单位制剂，能够以口服或非口服方式通过吸入喷雾向直肠内给药或者 局部给药，优选地，能够以非口服方式进行给药。局部给药还可包括透皮贴片之类的经皮给 药或利用离子泳动装置的给药。
[0074] 在本说明书中，"非口服给药"包括皮下注射、静脉内注射、肌肉内注射、胸骨内注 射或注入技术。例如药物制剂公布于文献（Hoover, John E.，Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. ,Easton, Pennsylvania, 1975)中。与药物制剂相关 的内容也可以在文献（Liberman, Η· Α·及 Lachman, L.，Eds.，Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y·，1980)中确认。
[0075] 包含在本发明的药剂学组合物的药剂学上接受的载体，作为制剂时通常所利用 的物质，虽包含乳糖、葡萄糖，蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸 盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲 酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等，但并不局限于此。本发明的药剂学 组合物除了上述成分之外，还可包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂及防 腐剂等。适合的药剂学上接受的载体及制剂详细记载于Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed·，1995)〇
[0076] 本发明的药剂学组合物的适合的给药量可通过制剂化方法、给药方式、患者的年 龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应感应性等因素来实施多 种处方。优选地，以成人为基准，本发明的药剂学组合物的给药量可以为〇. 001-100 μ g/ kg (体重）。
[0077] 本发明的药剂学组合物可根据所属领域普通技术人员能够容易实施的方法，利用 药剂学上接受的载体和/或者利用赋形剂来实现制剂化，从而可制备成单位容量形态或者 导入于多容量容器内来制备。此时，剂型可以为油或水性介质中的溶液、悬浮液、糖浆或乳 化液形态或浸膏剂、散剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂形态，且还可更多的包含分散剂或 稳定剂。
[0078]【有益效果】
[0079] 对本发明的优点及效果进行归纳如下：
[0080] ⑴本发明涉及在IFNa蛋白质结合细胞质转导肽（CTP)和聚乙二醇（PEG)的 IFNa融合蛋白。
[0081] (ii)本发明的IFNa融合蛋白的干扰素的固有活性得到较高的维持。
[0082] (iii)本发明的IFNa融合蛋白在向生物体给药时，使半衰期延长，肝移动能力提 尚。
[0083] (iV)本发明的IFNa融合蛋白能够使用于对包括各种病毒性感染等的肝脏疾病 的预防或治疗有效的蛋白质医药品的研发。 【【附图说明】】
[0084] 图1示出了 CTP通过接头结合的本发明的IFNa融合蛋白的结构。表示了 CFN7 (CTP-GGGGGG-IFN a，序列表中序列 32)、CFN8 (CTP-GGGG-IFN a、序列表中序列 33)、 插入有H印sin Cleavage接头的CFNlU序列表中序列34)、CFN12(序列表中序列35)、 CFN13(序列表中序列36)的结构。
[0085] 图2为利用⑶分光光度计（Jasco-815)来对通过结合接头来制备的本发明的 IFN α融合蛋白的二次结构进行分析的结果。
[0086] 图3示出了 PEG以多种形态与CTP-IFN α融合蛋白相结合的CTP-IFN a -PEG融合 蛋白。
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