马铃薯中的转化酶沉默使由斑马片和糖端所致的损失最小化的用图
【专利说明】马铃薯中的转化酶沉默使由斑马片和糖端所致的损失最小 化的用途
[0001] 相关申请案的夺叉参考
[0002] 本申请要求2012年11月9日提交的美国临时申请第61/724, 632号和2013年3 月14日提交的美国临时申请第61/783, 390号的优先权，其中的每一者以全文引用的方式 并入本文中。
技术领域
[0003] 本发明提供生产包括薯片和薯条的马铃薯产品的便利方法，所述产品糖端的发生 率较低和/或归因于感染斑马片病原体的显色不佳较少。
【背景技术】
[0004] 马铃薯（Potato/Solanum tuberosum)为世界上第三重要的粮食作物。其用于人 类食用、动物饲料以及作为淀粉和醇的来源。全球产量的超过三分之二被人类直接食用，其 余的中的许多喂食动物或用于生产淀粉。21世纪的第一个十年的平均全球公民的每年饮食 包括约33kg (或731b)马铃薯。
[0005] 在每一个生长季期间，马铃薯植株经受多种影响植物健康、产量和最终块茎品质 的生物和非生物逆境。由于田间的环境和栽培措施的综合效应所致的不佳块茎品质可以在 如薯条或薯片的最终产品中显现。次优生长年份和不佳栽培措施导致如褐斑病、空心病、内 部坏死、维管变色、斑马片和糖端的内部块茎病症的明显增加。具有这些病症的薯条成品必 须丢弃，对加工商构成经济损失。一些经济负担以违约处罚形式传递至种植者或以产品的 较高价格形式传递至消费者。
[0006] 因此，继续需要马铃薯块茎品质的提高，其为本发明所阐述的。
【发明内容】
[0007] 本发明提供使马铃薯块茎或由所述马铃薯块茎制得的产品中的糖端的频率最小 化的方法，其中马铃薯块茎中的糖端的频率相比于对照马铃薯块茎减少。在一些实施例中， 所述方法包含破坏所述马铃薯块茎中的液泡转化酶活性。
[0008] 本发明也提供使马铃薯块茎或由所述马铃薯块茎制得的产品中的斑马片症状最 小化的方法，其中马铃薯块茎中的斑马片症状相比于对照马铃薯块茎减少。在一些实施例 中，所述方法包含破坏所述马铃薯块茎中的液泡转化酶活性，
[0009] 可以通过任何合适的方法破坏液泡转化酶活性。在一些实施例中，通过将编码液 泡转化酶的液泡转化酶基因的一或多个核苷酸变化引入至马铃薯块茎中破坏液泡转化酶 活性。在一些实施例中，核苷酸变化自然地发生，或通过任何合适的方法人工地创造。在一 些实施例中，通过引入一或多个抑制性核苷酸序列破坏液泡转化酶活性。在一些实施例中， 抑制性核苷酸序列选自由反义RNA序列、dsRNAi序列和反向重复序列组成的群组。
[0010] 在一些实施例中，抑制性核苷酸可操作地连接于植物启动子。在一些实施例中，植 物启动子选自由组成性启动子、非组成性启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子和细胞 型特异性启动子组成的群组。
[0011] 在一些实施例中，组织特异性启动子为块茎特异性启动子。在一些实施例中，块茎 特异性启动子为与ADP葡萄糖焦磷酸酶基因相关的启动子。在一些实施例中，块茎特异性 启动子包含核酸序列SEQ ID NO:6,或任何因此的功能变异体或其功能片段。
[0012] 在一些实施例中，抑制性核苷酸序列为反向重复序列。在一些实施例中，反向重复 序列来源于SEQ ID NO: 5。在一些实施例中，反向重复序列包含至少一个有义序列和至少一 个反义序列，其与SEQ ID N0:5或其逆向互补序列的某一或某些部分具有至少80%、85%、 90%、95%、99%或99%以上的一致性。在一些实施例中，反向重复序列包含至少一个有义 序列和至少一个反义序列，其可以与SEQ ID N0:5或其逆向互补序列杂交。
[0013] 在一些实施例中，反向重复序列包含对应于SEQ ID NO: 5的+53至+733的有义序 列。在一些实施例中，反向重复序列包含对应于SEQ ID NO:5的+552至+49的反义序列。
[0014] 本发明也提供生产在通常导致诱发糖端的田间条件下并不产生具有糖端的块茎 的转基因植物的方法，和使用转化酶沉默使斑马片症状最小化或降低糖端频率的方法。
[0015] 在一些实施例中，本发明的方法包含在马铃薯植株中表达基因沉默盒。在一些实 施例中，所述盒包含有义序列和反义序列，其以反向重复序列形式定向。在一些实施例中， 有义序列与SEQ ID NO: 5具有100 %-致性。在一些实施例中，反义序列为有义序列的全长 或部分逆向和互补序列。在一些实施例中，有义序列和反义序列通过间隔子分离。在一些 实施例中，表达盒包含块茎特异性启动子。在一些实施例中，块茎特异性启动子可操作地连 接于有义和反义序列。在一些实施例中，盒的表达下调至少一个内源性转化酶基因的表达 从而使马铃薯块茎或由所述马铃薯块茎制得的产品中的糖端的频率最小化，和/或使马铃 薯块茎或由所述马铃薯块茎制得的产品中的斑马片症状最小化。在一些实施例中，有义序 列与SEQ ID N0:5的全长或部分序列100%-致。在一些实施例中，反义序列与有义序列 的逆向和互补序列100%-致。举例来说，有义序列可以是SEQ ID N0:3,并且反义序列可 以是SEQ ID N0:21。在一些实施例中，反义序列与有义序列的逆向和互补序列并非100% 一致，而是与其部分重叠，例如有义序列可以是SEQ ID N0:3,并且反义序列可以是SEQ ID N0:4〇
[0016] 本发明的方法为出乎意料的，因为基因功效与预先冷温度诱导严密相关（克兰 (Klann)等人，植物生理学（Plant Physiol) 1993 ;贝思克（Bethke)和江（Jiang),植物生 理学2010 ;叶（Ye)等人农业和食品化学杂志（J. Agric Food Chem) 2010)。
【附图说明】
[0017] 图1.糖端（SE)在几乎一半的'游侠'（A)和空白载体（B)对照薯条上显而易见。 品系1632-1(0和1632-4(D)关于转化酶沉默并且在与对照组相同的条件下生长和油炸时 不显示SEo
[0018] 图2.新鲜马铃薯切片上的重度㈧和轻度⑶斑马片症状。在整个块茎肉中的 组织坏死的严重症状在收获前35和28天（dbh)感染的块莖上显而易见。在收获前21天 的轻度感染块茎切片上可见较少坏死。在收获前14和7天的块茎上看见极少坏死或无坏 死。
[0019] 图3. (A)收获前35天（dbh) ; (B)收获前28天；（C)收获前21天；(D)收获前14 天；和（E)收获前7天来自'游侠'对照组（左侧）和转化酶沉默品系1632-1 (右侧）的薯 片样品。薯片由6-8个块茎的切片制得并且在375 T下油炸3分钟。达到最终2%水分含 量。
[0020] 图4.沉默多酚氧化酶（Ppo)消除斑马片感染块茎的氧化暗化。未感染CV. '大西 洋'块茎（A)中的多酚氧化酶作用将无色儿茶酚底物转化为切割块茎表面上的暗色沉淀。 未感染（B)或感染（C)Ppo沉默块茎均不显示暗化。显示三种不同块茎。在将0.4M儿茶酚 溶液涂覆于切割块茎表面上方15分钟之后拍摄照片。
[0021] 图5. Northerns展示转化酶（A)和Ppo (B)的沉默。每个Northern以下的溴化乙 锭染色RNA凝胶用于负载参考物。自温室生长块茎分离总RNA (20yg)。属于基因内事件和 对照组并且与Inv(A)和Ppo(B)探针杂交的块茎组织。
【具体实施方式】
[0022] 用电子方式提交的文本文件的描述
[0023] 提交的文本文件的内容以全文引用的方式并入本文中：序列表的计算机可读格式 复本（文件名：JRSI00202US_ST25.txt，录入日期：2013年11月8日，文件大小20千字节）。
[0024] 定义
[0025] 如本文所使用，如用于本说明书和权利要求书中的动词"包含"和其词形变化形式 在其非限制性意义上用于意指包括所述词语之后的项目，但不排除未专门提到的项目。
[0026] 术语"一（a) "或"一（an) "是指所述实体中的一或多者；举例来说，"一种基因"是 指一或多种基因或至少一种基因。因此，术语"一（a)"（或"一（an)"）、"一或多个（一或 多种）"和"至少一个（至少一种）"在本文中可互换地使用。另外，通过不定冠词"一（a) " 或"一（an) "提及"一个要素"并不排除存在一个以上要素的可能性，除非上下文明确要求 存在一个且仅存在一个要素。
[0027] 如本文所使用，术语"植物"是指属于植物界的任何活有机体（即植物界中的任 何属/种）。此包括熟悉的有机体，如（但不限于）树木、草本植物、灌木、禾草、藤本植物、 蕨类植物、藓类植物和绿色藻类。所述术语是指单子叶植物（monocotyledonous plant，也 称为monocot)和双子叶植物（dicotyledonous plant，也称为dicot)二者。举例来说， 在一些实施例中，植物为前属（Solanum genus)中的种，如马铃薯（S. tuberosum)、窄刀薯 (S.stenotomum)、富利哈薯（S.phureja)、角萼薯（S.goniocalyx)、阿加薯（S.ajanhuiri)、 乔查薯（S. chaucha)、尤杰普氏薯（S. juzepczukii)和短叶薯（S. curtilobum)。在一些实 施例中，植物为马铃薯种中的马铃薯品种。
[0028] 如本文所使用，术语"植物部分"是指植物的任何部分，包括（但不限于）芽、根、 茎、腋芽、种子、托叶、叶子、花瓣、花、胚珠、苞、分枝、柄、节、节间、茎皮、柔毛、新芽、根茎、 叶、叶片、花粉、花蕊、微管等。
[0029] 如本文所使用，术语"胚质"是指包含生物体的遗传素质的物理基础的基因材料以 及其特定分子和化学组成。
[0030] 如本文所使用，短语"来源于"是指起源或来源，并且可以包括天然存在的、重组、 未纯化或纯化分子。来源于起源或来源的核酸或胺基酸可以具有如在本文中其它地方定义 的所有类别的核苷酸变化或蛋白质修饰。
[0031] 如本文所使用，术语"后代"是指任何以来自一或多种亲本植物或其后代的无性或 有性繁殖的后代形式产生的植物。举例来说，后代植物可以通过亲本植物的克隆或自交或 通过两种亲本植物的杂交获得并且包括自交体以及Fl或F2或再另一代。Fl为产生自亲本 的第一代后代，其中的至少一者第一次用作具有性状的供体，而第二代（F2)或后续代（F3、 F4等）后代为产生自Fl's、F2's等的自交的标本。Fl因此可以是（并且通常是）由两个 真实遗传亲本（真实遗传对于性状纯合）之间的杂交产生的杂种，而F2可以是（并且通常 是）由所述Fl杂种的自花授粉产生的后代。
[0032] 如本文所使用，术语"杂交（cross/crossing) "、"异花授粉（cross pollination) " 或"杂交育种（cross-breeding)"是指将一株植物上的一朵花的花粉涂覆（人工或自然地） 到另一株植物上的花的胚珠（柱头）的过程。
[0033] 如本文所使用，术语"栽培品种"是指已通过园艺或农艺技术产生并且通常不发现 于野生型群体中的植物品种、品系或族类。
[0034] 如本文所使用，术语"植物组织"是指植物的任何部分。植物器官的实例包括（但 不限于）叶子、茎、根、块茎、种子、分枝、柔毛、节结、叶腋、花、花粉、花蕊、雌蕊、花瓣、梗、茎 杆、柱头、花柱、苞、果实、躯干、心皮、萼片、花药、胚珠、花梗、针叶、球果、根茎、匍匐茎、芽、 果皮、内胚乳、胎盘、浆果、雄蕊和叶鞘。
[0035] 如本文所使用，"植物启动子"为能够起始植物细胞中的转录，无论其来源是否为 植物细胞的启动子。
[0036] 如本文所使用，"严格杂交条件"包含在存在50%甲酰胺的情况下在42°C下杂交过 夜（12-24小时），接着洗绦，或在约65°C下持续约12到约24小时的5XSSC，接着在65°C 下在0.1 XSSC中洗涤约一小时。
[0037] 如本文所使用，"组成性启动子"为在大部分条件下和/或在大部分发育阶段期 间具活性的启动子。在用于植物生物技术的表达载体中使用组成性启动子存在若干优势， 如：用于选择转基因细胞或植物的蛋白质的高生产水准；报告蛋白或评估标记物的高表达 水准，使得易于检测和定量；调节转录系统的一部分的转录因子的高生产水准；生产在植 物中需要普遍存在的活性的化合物；和生产在植物发育的所有阶段期间所需的化合物。非 限制性示范性组成性启动子包括CaMV 35S启动子、冠癭碱启动子、泛素启动子、肌动蛋白 启动子、醇脱氢酶启动子等。
[0038] 如本文所使用，"非组成性启动子"为在某些条件下、在某些类型的细胞中和/或在 某些发育阶段期间具活性的启动子。举例来说，组织特异性、组织优先、细胞类型特异性、细 胞类型优先、诱导型启动子和在发育控制下为非组成性启动子的启动子。在发育控制下的 启动子的实例包括优先起始在某些组织，如茎、叶子、根或种子中的转录的启动子。
[0039] 如本文所使用，"诱导型"或"阻抑型"启动子为在化学或环境因素控制下的启动 子。可能影响通过诱导型启动子的转录的环境条件的实例包括厌氧条件或某些化学品或存 在光。
[0040] 如本文所使用，"组织特异性"启动子为仅仅在某些组织中起始转录的启动子。不 同于基因的组成性表达，组织特异性表达为若干相互作用水准的基因调节的结果。因此，在 所属领域中，有时优选的是使用来自同源或紧密相关植物种的启动子以实现转基因在特定 组织中的有效和可靠表达。这是大量自特定植物和组织分离的组织特异性启动子发现于科 学和专利文献中的主要原因之一。组织特异启动子的非限制性实例包括块茎特异性启动 子、叶特异性启动子、根特异性启动子、花特异性启动子、种子特异性启动子、分生组织特异 性启动子等。
[0041] 如本文所使用，"细胞类型特异性"启动子为主要驱动一或多个器官中的某些细胞 类型中的表达的启动子。
[0042] 如本文所使用，术语"品种"是指种的亚门，其由种内的在形式或功能上不同于其 它类似阵列的个体的一组个体组成。
[0043] 如本文所使用，术语"基因型"是指个别细胞、细胞培养物、组织、有机体（例如植 物）或有机体群组的基因组成。
[0044] 如本文所使用，术语"克隆体"是指起源于或来源于单一前驱物并且与其在基因上 相同或实质上相同的细胞、细胞群组、一部分、组织、有机体（例如植物）或有机体群组。在 一些实施例中，克隆体以包含至少一个无性生殖步骤的方法产生。
[0045] 如本文所使用，术语"杂种"是指由在一或多种基因中不同的亲本之间的杂交产生 的任何个别细胞、组织或植物。
[0046] 如本文所使用，术语"近交系"或"近交品系"是指相对真实遗传品系。
[0047] 如本文所使用，术语"群体"意指具有共同的基因起源的植物的遗传上同质或异质 的集合。
[0048] 如本文所使用，术语"品种"或"栽培品种"意指一组类似植物，其可以通过结构特 征和性能与相同种内的其它品种鉴别开来。如本文所用的术语"品种"与1961年12月2 日的保护植物新品种国际公约（International Convention for the Protection of New Variet