scoreaceae)〇
[0065] 转化酶
[0066] 转化酶（Inv) (EC 3. 2. L 26)(也称为β -呋喃果糖苷酶）是一种催化蔗糖水解的 酶，其产生果糖和葡萄糖。相关转化酶为蔗糖酶。转化酶和蔗糖酶水解蔗糖，得到葡萄糖和 果糖的相同混合物。转化酶裂解O-C(果糖）键，而蔗糖酶裂解O-C(葡萄糖）键。
[0067] 马铃薯转化酶描述于巴斯卡尔（Bhaskar)等人，植物生理学，2010年10月， 第154卷，第939-948页，德拉芬（Draffehn)等人，BMC植物生物学，2010, 10:271，叶等 人，农业与食品化学杂志2010 58:12162-12167和美国专利第7094606号，其中的每一 者以全文引用的方式并入本文中。其它马铃薯转化酶以登录号DQ478950. 1、JN661859. 1、 JN661860. 1、ΑΥ341425. 1、JN661854. 1、EU622806. 1、L29099. 1、JN661857. 1、JN661855. 1、 JN661858. 1、JN661856. 1、JN661853. 1、JN661852. 1、EU622807. UX70368. 1、JN661862. 1 和 JN661861. 1寄存于基因库中。与马铃薯转化酶具有高同源性的序列以登录号ΗΗ772321. 1、 ΗΗ772323. 1、ΗΗ772324. 1、ΗΗ772322.1、AR928219. 1、BD073570.1、161429. 1、129071.1、 164641.1、Ε54105.1、Ε16293.1、Ε08976.1、Ε09853.1、Ε07108. 1、ΗΗ977806. 1、164644.1、 164642. 1、129074. 1和129072. 1寄存于基因库中。所属领域的技术人员将能够基于已知 马铃薯转化酶基因鉴别和分离其它马铃薯转化酶基因。
[0068] 糖端
[0069] 糖端为主要在加工马铃薯中观测到的内部块茎病症并且主要影响长块茎，如'褐 色布尔班克（Russet Burbank) '。其显现为薯条的一端在油炸后暗化，通常位于块莖的莖干 端上。
[0070] 糖端不同于低温诱发甜化（cold-induced sweetening)，后者为在低温储存的马 铃薯块莖中还原糖积聚的现象（黛尔（Dale)和布拉德肖（Bradshaw) ,2003，改善马铃薯 的加工属性的进展（Progress in improving processing attributes in potato).植 物科学趋势（Trends Plant Sci)8:310-312;巴斯卡尔等人，抑制液泡转化酶基因防止 马铃薯中的低温诱发甜化（Suppression of the Vacuolar Invertase Gene Prevents Cold-induced Sweetening in Potato),植物生理学，2010 年 10 月，154:939-948)。低温 诱发甜化为许多栽培品种的马铃薯（Solanum tuberosum L )块茎在冷藏之后的块茎品质 问题，这是归因于所述过程中的己糖积聚。此由淀粉分解为蔗糖而引起，蔗糖被液泡酸转化 酶裂解为葡萄糖和果糖。在受影响块茎的加工期间，烘烤和油炸中涉及的高温引起还原糖 与游离胺基酸之间发生梅纳反应（Maillard reaction)，从而导致丙稀酰胺积聚。但是，糖 端是指由积聚在匍匐茎附接区域附近的一端的还原糖的焦化引起的暗化。糖端通常与植物 在块茎萌发和早期膨大期间必须经受高空气和土壤温度的时段相关。不希望受任何理论 束缚，人们相信高土壤温度抑制块茎中的糖转化为淀粉，从而增加受影响组织中的还原糖 浓度（汤普森（Thompson)等人美国马铃薯研宄杂志（Am. J. Potato Res. )85(5) :375-386 2008)。在此关键时间的水分亏缺也可能通过干扰组织之间糖的输送来加重糖端。种植者 对抗糖端的管理选择包括确保在早期块茎膨大期间湿度应力最小化和产生快速获得叶冠 并保持整季的环境。糖端可以迫使农民在生长高品质作物的潜力最大化的区域和田地中生 长马铃薯。斑马片
[0071] 马铃薯种植者关心的新的生物逆境为由细菌柑橘黄龙病菌（Candidatus Liberobacter solanacearum)引起的斑马片。参见塞科尔（Secor)等人（通过移植和木虱 传播、电子显微法和PCR建立的'柑橘黄龙病菌'与马铃薯斑马片疾病的关联（Association of iCandidatus Liberibacter solanacearum, with Zebra Chip Disease of Potato Established by Graft and Psyllid Transmission, Electron Microscopy, and PCR)，植 物疾病（Plant Diseases)，93(6) :574-583)和利夫廷（Liefting)等人，（'柑橘黄龙病菌'， 与前科植物相关（iCandidatus Liberibacter solanacearum,, associated with plants in the family Solanaceae),国际系统与进化微生物学杂志（International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology) ,2009, 59 (9): 2274-2276)。2000 年最 先在南德克萨斯发现的斑马片（ZC)已扩散到密西西比河（Mississippi River)以西的所 有主要生产马铃薯的州。它也是危地马拉（Guatemala)、洪都拉斯、墨西哥和新西兰的主 要问题，引起受感染植物的块茎的产量损失和品质问题。当前，不存在对于ZC病原体已 知的遗传抗性。种植者只能喷洒杀虫剂以阻止疾病的昆虫病媒马铃薯木虱（Bactericera cockerelli)。ZC病原体使得受感染块茎在切片和油炸时展现出暗明变色的显著条纹图案。 特征性条纹从显示晚期细胞死亡的严重感染块茎以及从不具有任何可见细胞死亡的轻度 感染块茎中显而易见。
[0072] 斑马片感染块茎具有较高含量的酚类化合物和酪氨酸，其可能造成切割块茎的快 速褐变反应（纳瓦拉等人，美国马铃薯研宄杂志86:88-95 2009)。患斑马片病的马铃薯块 茎的特征为增加含量的主体酚醛树脂、氨基酸和防御相关蛋白。（沃利斯等人生理与分子 植物病理学（Physiological and Molecular Plant Pathology) 78 (2012) 66-72)。由于多 酚氧化酶（Pp0)沉默先前已与块茎中减少的症状表达相关联（罗门斯等人农业与食品化学 杂志（J. Agric. Food Chem.) 2006, 55, 9882-9887)，将假设Ppo沉默可以减少感染块茎中的 ZC症状。但是，由于也假设Ppo沉默可能与加强的疾病易感性相关（提帕蓬（Thipyapong) 等人，植物（Planta) 2004, 220, 105-117)，Ppo沉默可能仅仅使ZC的症状和严重程度恶化。 本发明证实ZC感染块茎中加强的Ppo反应，但不显示减少感染ZC的油炸马铃薯的焦化颜 色的能力。此外，不可能在Ppo沉默相对于非Ppo沉默品系中显示减少的症状发展。上文 所提及的每一参考文献以全文引用的方式并入本文中。
[0073] 韧皮杆菌（Candidatus Liberibacter)为根瘤菌科（Rhizobiaceae family)中 的一种革兰氏阴性细菌。术语候选种（Candidatus)用于表明尚未论证可能在培养物中维 持此细菌。检测韧皮杆菌是基于用特异性引物对其16S rRNA基因进行PCR扩增。所述属 的成员为大多通过木虱传播的植物病原体。所述属最初拼写为Liberobacter。韧皮杆菌 的非限制性种包括韧皮杆菌非洲种、韧皮杆菌美洲种、韧皮杆菌亚洲种、韧皮杆菌欧洲种、 Liberibacter psyllaurous 和柑橘黄龙病菌。
[0074] 已揭示'柑橘黄龙病菌'的全基因组序列（林（Lin)等人，与马铃薯斑马片 疾病相关的细菌'柑橘黄龙病菌'的全基因组序列（The Complete Genome Sequence of iCandidatus Liberibacter solanacearum'，the Bacterium Associated with Potato Zebra Chip Disease),公共科学图书馆?综合（PL0S One)，201，6(4): el9135)。初步传播 试验强有力地表明马铃薯木虱为'柑橘黄龙病菌'的病媒。已表明木虱可以获得所述细菌， 但传播需要进行确认。另外，疾病流行病学的许多其它方面仍待研宄（例如通过种子或移 植物传播）。在长距离范围内，感染植物与木虱的交易可以扩散细菌。已发现'柑橘黄龙病 菌'与其它木虱种，B. trigonica和T. apicalis相关联，并且还与其它病原体（例如翠菊黄 化植原体（Aster yellows phytoplasma)、柑桔螺原体（Spiroplasma citri))混合传染。
[0075] 可以通过所属领域的技术人员已知的任何方法检测存在或不存在'柑橘黄龙病 菌'，例如通过观测马铃薯块茎中的斑马片症状，或通过基于核苷酸杂交的方法，如常规或 实时PCR(克罗斯林（Crosslin)等人，"通过常规和实时PCR检测马铃薯木虱Bactericera cockerelli(Sulc)中的'柑橘黄龙病菌'（"Detection of 'Candidatus Liberibacter solanacearum, in the Potato Psyl I id,Bactericera cockerelli(Sulc) , by Conventional and Real-Time PCR),西南昆虫学家(Southwestern Entomologi st) ,36(2) :125-135, 2011)。其它方法包括（但不限于）选自由以下组成的群组的免疫 检测测试：沉淀和凝集测试、免疫金标记、免疫吸附电子显微法、ELISA(例如侧流测试或 DAS-ELISA)、蛋白质印迹、RIA和/或点渍墨法测试，和其组合。
[0076] 方法
[0077] 本发明提供在如薯条或薯片的马铃薯产品中糖端发生率较低的生产马铃薯块茎 的方法。本发明也提供制造轻度感染斑马片病原体但具有较少严重症状，例如在油炸之后 具有较少显色不佳（尽管存在低滴度的病原体）的马铃薯产品的方法。
[0078] 马铃薯产品中的糖端的发生率可以通过所属领域的技术人员已知的方法，如在 下文实例1中描述的方法评估。在一些实施例中，由待测试马铃薯块茎制得的马铃薯产 品的颜色用作糖端的指标并且借助于用于马铃薯产品的比色卡，如USDA蒙赛尔比色卡 (Munsell Color Chart)相对于由对照马铃薯块茎制得的马铃薯产品测量。合适的对照马 铃薯块茎可以是具有未破坏转化酶，同时对照马铃薯块茎已经在与待测试马铃薯块茎相同 的条件下生长、收获和处理的任何对应马铃薯品种。在一些实施例中，由本发明的马铃薯 块茎制得的马铃薯产品具有糖端表型的百分比显著低于对照马铃薯块茎的百分比。举例 来说，由本发明的马铃薯块茎制得的马铃薯产品具有糖端表型的百分比为约〇%、1%、2%、 3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、1%、15%、16%、17%、18%、19%、 20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29% 或 30%。
[0079] 马铃薯产品中的斑马片（ZC)病原体症状可以通过所属领域的技术人员已知的方 法，如在下文实例2中描述的方法评估。在一些实施例中，可以在用病原体处理植株之后在 块茎上进行ZC严重程度（即块茎肉的坏死斑点）的视觉评估。在评估症状严重程度期间， 获取块茎样品用于进行关于存在或不存在韧皮杆菌的PCR校验。存在ZC与越来越暗的薯 片相关，植物暴露于对韧皮杆菌趋向性木虱的时间越长。在一些实施例中，对于油炸产品， 产品可以在比较之前在油中在约300F、350F、400F或450F下油炸约1、2、3、4、5分钟或5分 钟以上以在产品中达到约1 %、2%、3%、％、5%最终湿度。在一些实施例中，通过视觉观测 检测产品的显色并且反映于艾格壮读数（Agtron reading)中。较高艾格壮读数与较浅颜 色相关。由具有经破坏转化酶基因的马铃薯块茎制得的产品相比于由对照马铃薯块茎制得 的产品具有较浅颜色，表明较不严重的症状。
[0080] 在一些实施例中，所述方法包含破坏所述马铃薯植物中的转化酶基因/酶活性。 在一些实施例中，转化酶为液泡转化酶。在一些实施例中，至少在马铃薯块茎中破坏转化酶 基因/酶活性。在一些实施例中，仅在马铃薯块茎中破坏转化酶基因/酶活性。如本文所 使用，术语"破坏（disrupted/disrupting/disruption) "是指马铃薯植株中的液泡转化酶 活性以使其相比于对照植株中的转化酶活性经降低、减少或甚至完全消除的方式修饰。
[0081] 破坏酶活性的方法已为所属领域的技术人员已知。这些方法包括（但不限于）突 变诱发（例如化学突变诱发、辐射突变诱发、转座子突变诱发、插入型突变诱发、签名标记 突变诱发、定点突变诱发和天然突变诱发）、基因敲除/基因敲入、反义和RNA干涉。不同类 型的突变诱发可以用于生产和分离具有破坏的液泡转化酶活性的马铃薯植株。其包括（但 不限于）定点、随机点突变诱发、同源重组（DNA改组）、使用含有模板的尿嘧啶的突变诱发、 寡核苷酸定向突变诱发、硫代磷酸酯修饰DNA突变诱发、使用间隙双螺旋DNA的突变诱发 等。其它合适的方法包括点错配修复、使用修复缺陷宿主病毒株的突变诱发、限制-选择和 限制-纯化、缺失突变诱发、通过总基因合成的突变诱发、双链断裂修复等。例如涉及嵌合 构筑体的突变诱发也包括在本发明中。在一个实施例中，可以通过天然存在的分子或经更 改或经突变的天然存在的分子的已知信息（例如序列、序列比较、物理特性、晶体结构等） 来引导突变诱发。关于植物中的突变诱发的更多信息，如药剂、方案，参见阿库瓦（Acquaah) 等人（植物遗传和育种原理（Principles of plant genetics and breeding)，威立-布 莱克威尔（Wiley-Blackwell)，2007, ISBN 1405136464, 9781405136464,其以全文引用的方 式并入本文中）。
[0082] 在一些实施例中，所述方法包含通过使用一或多个抑制性核苷酸序列，如用 于RNA干涉、反义寡聚核苷酸、微RNA和/或立体阻断寡核苷酸的核苷酸序列破坏 马铃薯植株中的内源性转化酶基因的活性（参见科勒（Kole)等人，RNA治疗剂：除 了 RNA 干涉和反义寡聚核苷酸（RNA therapeutics:beyond RNA interference and antisense oligonucleotides),药物发现（Drug Discovery), 2012, 11:125-140;奥 索斯基（Ossowski)等人，使用人工微RNA和其它小RNA的植株中的基因沉默（Gene silencing in plants using artificial microRNAs and other small RNAs),植物杂志