br>[0119] 在位于爱达荷州帕尔马（Parma, Idaho)的爱达荷州帕尔玛大学研宄与推广中心 (University of Idaho Parma Research and Extension Center)于第 I 年和第 2 年进行 使用未转化对照组、空白载体对照组和转化酶沉默品系的田间试验。遵循由爱达荷大学推 荐的管理建议应用大量和微量营养素。使用在整个生长季中将湿度维持在65%以上的固 定式喷灌系统喷灌小块土地。在第1年，每个对照和转基因系由5个点播穴的1小块土地 代表。在第2年，每个对照和转基因系由20个点播穴的5小块土地代表。在两年中，行内 距均为10英寸，行间距为36英寸。距种植130-140天收获块茎且储存在55°C下直到油炸 (约2周）。
[0120] 在第1年，油炸样品由获自5个点播穴的汇集样品的最小十二镑的块茎组成。在 第2年，使用来自汇集堆集（每个复制20个点播穴）的20个块茎并且测量所有5个复本。 第2年每品系的块茎平均数为5X20或100个块茎。所有块茎在3/8-英寸X3/8-英寸网 格油炸小刀上纵向切割并且将四个中心条在375 °F下油炸3分钟。将油炸条放在白色盘上 并且与炸薯条的USDA蒙赛尔比色卡相比。对于所述条的全宽，测试数3, SE薯条在所述条 的最暗两侧上具有1/4英寸长或更长的端部或当相比于USDA蒙赛尔比色卡时较暗。
[0121] 如表1中所示，在爱达荷州帕尔玛田间，两年都存在适合于诱发糖端的条件。在 第1年，由于种子供应有限所致的小样品尺寸显示所有品系的糖端都减少的趋势。尽管未 转化对照组（游侠对照组）和空白载体对照组的几乎一半中心薯条显示糖端，转化酶沉默 品系全部显示显著减少。此事实也从显示每个样品的所有中心薯条的图1中的说明显而易 见。如图1中所示，惊人地少数的转化酶沉默品系显示任何具有糖端的薯条。品系1和4 以油炸样品中无糖端为特点。相对于42%在油炸后显示糖端的对照薯条，其它转化酶品系 显示小于14%具有糖端的薯条。在可能有更多复制的第2年观测到转化酶沉默品系显示 糖端的相当大减少的相同图案。品系1632-1在两年中都极好，平均仅仅有4±2. 3 (土标准 差）显示任何程度的糖端的薯条。两个复本无具有糖端的条。其它品系在第2年显示较少 减少，表明较大样品尺寸在研宄糖端时的重要性。
[0122] 表1.来自转化酶沉默褐色游侠（1632-x)、空白载体对照组和未转化（游侠对照 组）块茎的具有糖端（SE)的中心切割薯条的频率。对于所述条的全宽，测试数3, SE薯条 在所述条的最暗两侧上具有1/4英寸长或更长的端部（用于测量的薯条行业中使用的较暗 区的长度），或当相比于炸薯条的USDA蒙赛尔比色卡时较暗。*由于有限量的种子而无复 制。**每个品系和对照组复制5次。 §具有糖端的薯条的平均数土标准差
[0124] 实例2 :使如薯片和薯条的油炸马铃薯产品的斑马片诱导的暗化的严重程度最小 化的转化酶沉默
[0125] 产生用于斑马片（ZC)实验的转化酶沉默品系为上文所述。对于显示降低的糖端 频率的相同品系测试使经斑马片的病因感染的薯片中的颜色产生最小化的能力。在位于德 克萨斯州布什兰德（Bushland，TX)的德州农工大学布什兰德研宄与推广中心（Texas A&M University Bushland Research and Extension Center)进行关于未转化对照组、空白载 体对照组和转化酶沉默品系的使用温室生长种子的田间试验。种子种植于4月11日。将 每个处理四株植物种植于区块中并且在出苗之后通过帐篷覆盖。帐篷用于使植物避开不必 要的动物群和将感染木虱（ZC病因生物体的病媒）保持于植物上。包含在帐篷内的每品系 四株植物在收获之前35、28、21、14和7天经30只携有韧皮杆菌的木虱感染。以此方式，块 茎产生自渐进地或多或少感染斑马片的每个品系和对照组。在收获前35天感染的植物将 可能经系统感染并且显示极强ZC症状（图3B和图4)，油炸的所得薯片极暗。在收获前21 天感染的植物预期仅仅在块茎中显示极轻度感染症状（图3A)并且将可能经油炸而具有中 等量的暗化。仅仅在收获前7天感染的植物预期显示极少感染迹象或无感染迹象并且将可 能具有经油炸而具有极少暗化或无暗化的块茎。
[0126] 在收获使，对于来自每个品系和处理的块茎分析ZC症状。对来自每个处理的8个 块茎进行ZC严重程度（即块茎肉的坏死斑点）的视觉评估。切割匍匐茎端并且关于症状 给予块茎〇到3的评级，其中3显示最大量的块茎坏死并且0显示无坏死。表2概括每个 品系在每个感染时间的疾病严重性评分。正如所料，对照块茎在收获前35和28天（dbh) 显示严重感染迹象，在整个块茎肉中具有坏死组织的明显斑点和条痕（参见图2A)。在收获 前21天感染的块茎可能偶尔在块茎的皮层中显示轻微坏死斑点，如图2B中所示。以极少 或无坏死为特点的逐渐较少感染迹象在较接近收获的天数显而易见。转化酶沉默品系的评 分不好于未转化褐色'游侠'对照组，显示新症状无法通过转化酶沉默缓解。在评估症状严 重程度期间，获取块茎样品用于进行关于存在或不存在韧皮杆菌的PCR校验。
[0127] 表2. ZC感染和未感染块茎的平均疾病严重程度评级。多酚氧化酶沉默品系和转 化酶沉默品系通过适当的未转化对照组指定。来自每个处理的8个块茎在匍匐茎端处经切 割并且以0与3之间标度评级，其中3对应于最大量块茎坏死并且0显示无坏死。值表示 所有8个块茎的平均值。DBH=收获前天数。J3、E12和FlO分别为'大西洋'（Atl)、褐色 布尔班克（RB)和褐色'游侠'（RR)背景下的Ppo沉默品系。所有1632个品系在褐色'游 侠'背景下对于Inv沉默。
[0129] 进行每感染天数将6-8个对照块茎的削片以查看ZC感染对成品薯片颜色的影响。 将一镑切片样品在油中在350F下油炸3分钟以在薯片中达到2%最终湿度。如图3中所 见，存在ZC与越来越暗的薯片相关，植物暴露于韧皮杆菌趋向性木虱的时间越长。通过艾 格壮读数测量的薯片颜色随着ZC压力在较接近收获的日期减小而在'游侠'对照薯片中暗 度变为较小（表3)。进行每感染天数6-8个转化酶沉默块茎的削片以查看转化酶沉默对油 炸薯片中受ZC影响的显色的表现的影响。如在艾格壮读数中和从薯片颜色的可见检查所 反映，转化酶沉默使得在每一感染时间点的薯片颜色较浅。甚至严重感染的块茎相比于'游 侠'对照块茎也较浅；尽管来自感染前35和28天的薯片仍滞销。根据此实验的结果，来自 轻微感染块茎（< 21dbh)的薯片将可能全部可销售。
[0130] 表3.制备自具有和不具有转化酶沉默的ZC感染和未感染块茎的薯片的艾格壮读 数。每个值为相同样品的3个读数的平均值。某些数据点由于作物歉收而缺失。较高值对 应于较浅油炸颜色。DBH=收获前天数。
[0131]
[0132] 实例3 :并不使与斑马片相关的症状最小化的多酚氧化酶沉默
[0133] 多酚氧化酶-55' -UTR(Ppo5, SEQ ID NO:8和9)的有义和反义片段配置为两个会 聚启动子一ADP葡萄糖焦磷酸酶基因（Agp，SEQ ID NO:6)与颗粒结合合成酶基因（Gbss， SEQ ID NO: 11)的启动子之间的反向重复序列以诱发Pp〇5基因沉默。Ppo 5'UTR的有义和 反义片段通过非编码间隔子DNA(SEQ ID N0:12)分离。先前描述的此基因沉默方法（颜 (Yan)等人植物生理学（Plant Physiol. ) 141:1508-1518, 2006)确保Ppo基因的沉默，但下 至Pp0 cDNA序列的21-23碱基对的Ppo基因的任何片段可以用于沉默。先前已描述用于 产生基因内品系F10、E12和J3的无 P-DNA载体和标记物方法（罗门斯（Rommens)等人， 植物生物技术杂志（Plant Biotechnol. J. ),6:843-853, 2008) 〇
[0134] 如前述实例中所述进行含有多酚氧化酶沉默盒的农杆菌的LBA4044菌株的制备 和生长。如前述实例1中关于产生转化酶沉默品系所描述进行产生Ppo沉默品系的马铃薯 转化。未转化植物和其基因内对应物的块茎中的Pp〇5基因的转录水准通过Northern印迹 分析测定（图5B)。在温室生长块茎中，F10、E12和J3基因内事件中的Pp 〇5基因的转录水 准相比于其未转化对照组强烈减少，表明Pp〇5基因在修饰块茎中经沉默。我们选择在'大 西洋'、褐色布尔班克和褐色'游侠'品种背景下沉默Ppo。所有三个品种对于黑斑挫伤敏 感，但当经Ppo沉默盒转化时，其对于黑斑挫伤不显示易感性。此事实关于'大西洋'野生 型和Ppo沉默等效物说明于图4A和4B中。
[0135] 如上文关于转化酶沉默品系所描述在位于德克萨斯州布什兰德的德州农工大学 布什兰德研宄与推广中心进行关于未转化对照组、空白载体对照组和Ppo沉默品系的使用 温室生长种子的田间试验。对Ppo沉默品系和其对应对照组的新ZC症状计分的方法为上 文所述并且概述于表2中。从这些评分中，显而易见的是Ppo沉默在三个品种背景中的任 一者下都不使ZC感染块茎中的新症状发展最小化。多酚氧化酶沉默品系的评分不好于未 转化对照组，显示新症状无法通过Ppo沉默缓解。更重要的是，在根据上文实例2中所述的 方法油炸可用的品系之后，显而易见的是Ppo沉默并不使得ZC感染薯片较浅。表4中的艾 格壮读数显示Ppo沉默J3不比未转化'大西洋'对照组更浅。当比较E12品系与褐色布尔 班克对照组或FlO品系与褐色'游侠'对照组时，这也是正确的。
[0136] 表4.制备自具有和不具有多酚氧化酶沉默的ZC感染和未感染块茎的薯片的艾格 壮读数。每个值为相同样品的3个读数的平均值。某些数据点由于作物歉收而缺失。较高 值对应于较浅油炸颜色。DBH=收获前天数。
[0137]
[0138] 我们确认切割或剥皮、ZC感染块茎的快速褐变反应（纳瓦拉（Navarre)等人，美 国马铃薯研宄杂志（Amer. J. Potato Res.) 86:88-952009)。如在图4中所观测，多酚氧化酶 沉默抑制这种反应。未感染（4B)或感染（4C)Ppo沉默块茎均不显示暗化。
[0139] 除非另外定义，否则本文中的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的一般 技术人员通常所理解相同的含义。尽管在本发明的操作或测试中也可以使用与本文中描述 的方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但是优选的方法和材料描述于本文中。所引 用的所有公开案、专利和专利公开案都出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。
[0140] 提供本文中论述的公开案仅仅用于在本申请的申请日之前对其进行揭示。不应将 本文中的任何内容理解为承认本发明无权先于凭借先前发明的此类揭示内容。
[0141] 尽管已结合其特定实施例描述本发明，应了解，其能够进一步修改并且本申请意 图涵盖一般来说遵循本发明的原理并且将与本发明的所述背离包括为在本发明所涉及的 所属领域内的已知或惯用实践范围内并且包括为可以应用于上文阐述和如下的所附权利 要求书的范围中的基本特征的本发明的任何变化、使用或修改。
【主权项】
1. 一种使马铃薯块茎或由所述马铃薯块茎制得的产品中的糖端频率最小化的方法，其 包含破坏所述马铃薯块茎中的液泡转化酶活性，其中所述马铃薯块茎中的所述糖端频率相 比于对照马铃薯块茎减少。2. -种使马铃薯块茎或由所述马铃薯块茎制得的产品中的斑马片症状最小化的方法， 其包含破坏所述马铃薯块茎中的液泡转化酶活性，其中所述马铃薯块茎中的斑马片症状相 比于对照马铃薯块茎减少。3. 根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述液泡转化酶活性通过将编码所 述液泡转化酶的液泡转化酶基因的一或多个核苷酸变化引入到所述马铃薯块茎中而破坏。4. 根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述液泡转化酶活性通过引入抑制 性核苷酸序列而破坏。5. 根据权利要求4所述的方法，其中所述抑制性核苷酸序列选自由反义RNA序列、 dsRNAi序列和反向重复序列组成的群组。6. 根据权利要求4所述的方法，其中所述抑制性核苷酸可操作地连接于植物启动子。7. 根据权利要求6所述的方法，其中所述植物启动子选自由组成性启动子、非组成性 启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子和细胞型特异性启动子组成的群组。8. 根据权利要求7所述的方法，其中所述组织特异性启动子为块茎特异性启动子。9. 根据权利要求8所述的方法，其中所述块茎特异性启动子为与ADP葡萄糖焦磷酸酶 基因相关的启动子。10. 根据权利要求9所述的方法，其中所述块茎特异性启动子包含核酸序列SEQID NO: 6,或因此的任何功能变异体或其功能片段。11. 根据权利要求5所述的方法，其中所述抑制性核苷酸序列为反向重复序列。12. 根据权利要求11所述的方法，其中所述反向重复序列来源于SEQIDNO:5。13. 根据权利要求12所述的方法，其中所述反向重复序列包含对应于SEQIDNO: 5的 +53到+733的有义序列。14. 根据权利要求13所述的方法，其中所述反向重复序列包含对应于SEQIDNO: 5的 +552到+49的反义序列。15. 根据权利要求12所述的方法，其中所述反向重复序列包含有含选自由SEQID NO:3、15、16和18组成的群组的聚核苷酸序列的有义序列。16. 根据权利要求15所述的方法，其中所述反向重复序列包含有含选自由SEQID N0:4、13、14、17和21组成的群组的聚核苷酸序列的反义序列。17. 根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述方法包含在马铃薯植物中表达 基因沉默盒，其中所述盒包含以反向重复序列形式定向的有义序列和反义序列，其中所述 有义序列可以与SEQIDN0:5在严格杂交条件下杂交，并且所述反义序列为所述有义序列 的全长或部分逆向和互补序列。18. 根据权利要求17所述的方法，其中所述有义序列和所述反义序列由间隔子分隔。19. 根据权利要求17所述的方法，其中所述表达盒包含块茎特异性启动子。20. 根据权利要求19所述的方法，其中所述块茎特异性启动子可操作地连接于所述有 义序列和所述反义序列。21. 根据权利要求17所述的方法，其中盒的表达下调至少一个内源性转化酶基因的表 达从而使马铃薯块茎或由所述马铃薯块茎制得的产品中的糖端频率最小化，和/或使马铃 薯块茎或由所述马铃薯块茎制得的产品中的斑马片症状最小化。22. 根据权利要求17所述的方法，其中所述有义序列与所述全长或部分SEQID N0:5100%-致。23. 根据权利要求17所述的方法，其中所述反义序列与所述有义序列的所述逆向和互 补序列100%-致。24. 根据权利要求17所述的方法，其中所述反义序列并非与所述有义序列的所述逆向 和互补序列100%-致，而是与其部分重叠。
【专利摘要】本发明提供一种生产如薯片和薯条的马铃薯产品的便利方法，所述产品的糖端发生率较低并且由于感染斑马片病原体所致的显色不佳较少。
【IPC分类】C12N15/87, C12N15/82
【公开号】CN104919047
【申请号】CN201380069669
【发明人】C·里克尔, J·叶, C·罗门思
【申请人】杰.尔.辛普洛公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2013年11月11日
【公告号】CA2891114A1, EP2917352A1, US20140137295, WO2014074990A1