一种具有抗病毒和免疫活性的亚麻籽多糖的制备及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药和功能性食品领域，具体涉及一种具有抗病毒和免疫活性的 亚麻籽多糖的制备及其应用。
【背景技术】
[0002] 亚麻（Linum ustitatissimum L.)又称胡麻，属亚麻科、亚麻属植物。作为一种传 统的油料作物，亚麻籽富含不饱和脂肪酸、必需氨基酸、维生素E及糖类化合物等多种营养 成分，其中多糖类物质主要存在于亚麻籽壳中，含量随产地和品种不同而有所差异。
[0003] 多糖又称多聚糖（Polysaccharide)，是由10个以上的单糖通过糖苷键连接而成 的一种高分子化合物，其相对分子质量为数万至数百万。多糖在自然界分布极广，在高等植 物、藻类、菌类及动物体内均有存在，如真菌多糖、植物多糖、动物多糖、藻类多糖、细菌多糖 等，是自然界含量最丰富的生物聚合物，已知的天然多糖化合物约有300多种。多糖具有多 种生物学功能，如细胞特异性识别，细胞表面对各种抗原和药物的受体，激活免疫细胞等， 尤其是植物多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗衰老、降血糖等多种生物活性，愈来愈引起人们 的兴趣。植物多糖作为天然活性物质，最大优点是毒副作用小，来源广泛。此外，研究表明， 具有硫酸酯结构的多糖通常表现出较强抗病毒活性，而具有三螺旋结构的多糖其免疫调节 功能要显著高于其它多糖。多糖类物质具有广泛多样化的生理功能且对机体几乎没有毒副 作用，是理想的药物赋形剂。
[0004] 传统亚麻籽多糖的提取多采用热水浸提法，目前公开的与亚麻籽多糖提取相关的 专利有：中国专利申请公布号CN1221771、CN1242952、CN1263139,这些专利涉及的内容都 是关于传统的热水浸提亚麻籽胶工艺的改进，所提取的亚麻籽多糖未发现有硫酸酯基团和 三螺旋高级结构。
【发明内容】
[0005] 为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种具有抗病毒 和免疫活性的亚麻籽多糖的制备方法。
[0006] 本发明的另一个目的在于提供上述制备方法获得的具有抗病毒和免疫活性的亚 麻籽多糖。
[0007] 本发明的再一个目的在于提供上述具有抗病毒和免疫活性的亚麻籽多糖的应用。
[0008] 为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
[0009] -种具有抗病毒和免疫活性的亚麻籽多糖的制备方法，包括以下步骤：
[0010] (1)亚麻籽壳仁分离：亚麻籽经粉碎机粉碎后，过筛，将过筛后的亚麻籽粉与甘油 和乙醇充分混和，离心20~30min，分别收集上层亚麻籽仁和沉积在底层的亚麻籽壳；
[0011] (2)亚麻籽多糖的提取：以步骤（1)获得的亚麻籽壳为原料，微波辅助热水浸提多 糖，提取液过筛，收集浓缩液，真空冷冻干燥；
[0012] (3)亚麻籽多糖的分离：将步骤（2)冷冻干燥后的粗提物用Sevage法脱蛋白25~ 30次，3500~5000r/min离心20~30min，取上清液；向上清液中加入无水乙醇，静置沉淀 (即醇沉）4~12h，3500~5000r/min离心20~30min，取沉淀，真空冷冻干燥后得到亚麻 籽粗多糖；
[0013] (4)亚麻籽多糖的纯化：将步骤（3)获得的亚麻籽壳粗多糖配成5~8mg/mL溶液， 用层析柱A纯化，水洗并用苯酚硫酸法检测多糖，合并糖反应阳性收集液，50~60°C旋转蒸 发浓缩，透析后真空冷冻干燥；将干燥后的多糖配成2~5mg/mL溶液，用层析柱B纯化，用 蒸馏水洗脱，收集多糖组分，透析，超滤，浓缩、冷冻干燥，得到所述具有抗病毒和免疫活性 的亚麻籽多糖（FHP-1)。
[0014] 步骤（1)所述的亚麻籽壳仁分离是根据不同体积比的甘油和乙醇（15 :3~4)利 用密度差实现亚麻籽壳仁的有效分离，亚麻籽粉碎后过20目筛。
[0015]步骤（2)所述的微波辅助热水浸提的条件为：料液比1:20~l:30(w/v)、浸提温 度60~100°C、浸提时间40~60min、输出功率600~800W、搅拌速度600~900r/min ;微 波辅助热水浸提所得的提取液过100目筛。
[0016] 步骤（3)所述的Sevage试剂的配制方法为将氯仿、正丁醇按体积比3 :1~5 :1混 合。
[0017] 步骤（3)所述的Sevage法脱蛋白的方法具体为：将步骤（2)冷冻干燥后的粗提物 与Sevage试剂按体积比1 :1~1 :3混合，振摇20~30min，3500~5000r/min离心20~ 30min，取出上层多糖溶液；再按上述步骤重复25~30次（即把所得上层溶液重复如下处 理过程25~30次：与Sevage试剂按体积比1 :1~1 :3混合，振摇20~30min，3500~ 5000r/min离心20~30min，取上层溶液）。
[0018] 步骤（3)所述的无水乙醇加入量为亚麻籽壳粗多糖溶液体积（是指上层溶液）的 3~5倍，加入无水乙醇后于4°C下静置沉淀4~12h。
[0019] 上清液有3层，下面那层是澄清的（有机试剂），中间那层是白色乳化层（蛋白 层），最上面那层是亚麻籽壳粗多糖多糖溶液。
[0020] 步骤（4)所述的亚麻籽多糖纯化过程中所用柱层析A为DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱，所述层析柱B为Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱；所述超滤过程中所用的 膜截留分子量为1 X 106Da ;所述透析时间为48小时，透析袋截留分子量为3000~5000Da。
[0021] 上述制备方法获得的具有抗病毒和免疫活性的亚麻籽多糖（FHP-1)，所述亚麻籽 硫酸酯多糖（FHP-1)组分均一，经凝胶渗透色谱（GPC)测定其平均分子量为2626kDa，经衍 生化后气相测定发现其主要由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖和岩藻糖七 种单糖组成。
[0022] 所述具有抗病毒和免疫活性的亚麻籽多糖具有三螺旋结构及硫酸酯基团的特殊 结构，同时具有抗乙肝病毒和增强免疫应答的功能。
[0023] 所述具有抗病毒和免疫活性的亚麻籽多糖（FHP-1)同时具有抗乙肝病毒和增强 免疫应答的功能，可将其作为预防乙肝病毒HBV感染、治疗免疫缺陷或改善免疫力低下的 功能性食品。
[0024] 与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
[0025] (1)本发明在传统的热水浸提法中引入微波辅助提取技术，利用微波热效应使萃 取体系中的溶剂更高效地破坏亚麻籽壳表皮组织中的细胞壁，使多糖内容物更好地被提取 出来。本方法与传统的热水浸提法（温度、料液比相同的条件下）相比，得到相同提取率的 亚麻籽硫酸酯多糖，提取时间缩短了 6~8倍，大大地提高了提取效率。
[0026] (2)为了深入开发利用亚麻籽资源，我们还对分离纯化后亚麻籽硫酸酯多糖进行 了化学结构鉴定、抗病毒试验以及免疫调节活性试验。本发明首次利用不同比例的甘油和 乙醇实现了亚麻籽壳仁的有效分离，结构鉴定中首次发现亚麻籽硫酸酯多糖具有三螺旋高 级结构及硫酸酯基团，并首次证明了亚麻籽硫酸酯多糖具有抗乙肝病毒活性和免疫调节活 性，在预防HBV的药品及提高机体免疫功能的食品和保健品领域有广阔的应用前景。
[0027] 亚麻籽硫酸酯多糖（FHP-1)经刚果红实验分析，FHP-1与刚果红形成络合物的最 大吸收波长同空白对照刚果红相比发生红移。表明FHP-1能与刚果红形成络合物，有规则 的三螺旋构象。元素分析表中含有〇. 85%的S元素，经硫酸钡比浊法测定FHP-1中的硫酸 基含量为2. 63%，结合红外图谱中，1244cm1为S = 0伸缩振动，823. 71cm 1硫酸基位于单 糖残基的平伏位置，表明亚麻籽硫酸酯多糖FHP-1中存在少量的硫酸酯结构。
[0028] 毒性试验显示，本发明亚麻籽硫酸酯多糖（FHP-1)多糖在1000mg/mL浓度下对 IfepG2. 2. 15、RAW264. 7细胞无细胞毒性；添加了 FHP-1的药物组与空白对照相比，能明显够 降低乙肝表面抗原（HBsAg)、乙肝e抗原（HBeAg)的表达和抑制乙肝病毒DNA的表达水平， 同时FHP-1显著提高小鼠巨噬细胞Raw264. 7分泌肿瘤坏死因子TNF-a、白细胞介素IL-6、 IL-12及炎症因子N0,具有显著的抗病毒活性和免疫调节功能，可用于作为预防HBV的药品 以及提高机体免疫功能的食品和保健品。本发明公布的亚麻籽硫酸酯多糖制备方法简单可 靠，可大规模生产。
[0029] (3)本发明亚麻籽原料来源广泛，方法简单可靠，产品安全性高，无毒副作用，可大 批量生产，有望开发成预防乙型肝炎的药品及提高机体免疫力的功能性食品。
【附图说明】
[0030] 图1是亚麻籽硫酸酯多糖的提取纯化及应用技术流程图。
[0031] 图2是亚麻籽壳表面的扫描电镜图，其中a为微波辅助提取前，b为微波辅助提取 后。
[0032] 图3是亚麻籽粗多糖纯化DEAE-Sepharose Fast Flow洗脱曲线。