1)抗病毒活性试验
[0065] MTT实验取活化的对数生长期IfepG2. 2. 15细胞以1 X 106个/mL浓度接种于96孔 板，置于5% C02, 37°C条件下培养，24h后，换加亚麻籽硫酸酯多糖药物组150 y L，以不加药 物组作为空白对照，继续培养。24h后加入20 y L MTT溶液，继续培养4h后终止培养，吸去 孔内培养液。每孔加入150yL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡lOmin，使结晶物充分溶解。
[0066] 细胞存活率计算公式如下：
[0067] 存活率=4/A。，其中&为样品组平行试验的吸光值，A。为对照组平行试验的吸光 值。
[0068] 亚麻籽硫酸酯多糖（FHP-1)对IfepG2. 2. 15细胞存活率的影响如图8的（a)所示， 存活率都大于90%，说明FHP-1对IfepG2. 2. 15细胞无抑制作用。
[0069] 取活化的对数生长期IfepG2. 2. 15细胞，用6cm培养板培养，每个培养板细胞数为 50万。24h后加亚麻籽硫酸酯多糖药物组，以不加药物组为阴性对照，加20 y g/mL的拉米夫 定作为阳性对照。培养24h收集培养上清液，并加入新的细胞液培养。将上清液稀释100倍 以检测HBsAg，稀释10倍检测HBeAg，并检测不同浓度组上清液中的HBV-DNA的含量。HBeAg 和HBsAg的检测按对应的试剂盒说明书操作，HBV-DNA的检测按普通QPCR的试剂盒说明书 操作。在酶标仪于450nm处测量各孔的吸光值，结果分别如图8的（b)、（c)、（d)所示。结 果表明加了 FHP-1的药物组与空白对照相比明显的抑制了 HBeAg、HBsAg的分泌和HBV-DNA 的复制，对抗HBV病毒有显著作用。
[0070] 实施例8 :亚麻籽硫酸酯多糖（FHP-1)免疫活性试验
[0071] MTT实验RAW264. 7以细胞以1X106个/mL浓度接种于96孔板，于5% C02,37°C条 件下培养，24h后，去除上清液换新鲜培养液，加入20 y L的亚麻籽硫酸酯多糖药物，以不加 药物组作为空白对照，加20 y g/mL的脂多糖作为阳性对照继续培养。24h后加入20 y L MTT 溶液，继续培养4h后终止培养，吸去孔内培养液。每孔加入150 y L二甲基亚砜，置摇床上 低速振荡lOmin，使结晶物充分溶解。结果如图9的（a)所示，亚麻籽硫酸酯多糖（FHP-1) 对RAW264. 7细胞存活率的影响存活率都大于90%，说明FHP-1对RAW264. 7细胞无抑制作 用。
[0072] 将小鼠腹腔巨噬细胞加入96孔板中培养24h，加入待测样品100 y L继续培养 36h，后续实验按照相应的IL-6, IL-12, TNF-a、NO酶联反应试剂盒的操作进行试验，结果 分别如图9的（d)、（b)、（c)、（e)所示。结果显示，药物组与空白对照组相比，药物组显著 提高了小鼠巨噬细胞Raw264. 7分泌肿瘤坏死因子TNF-a、白细胞介素IL-6、IL-12及炎症 因子N0,具有显著的抗病毒活性和免疫调节功能。
[0073] 毒性试验显示，本发明FHP-1多糖在1000mg/mL浓度下对IfepG2. 2. 15、RAW264. 7 细胞无细胞毒性；添加了 FHP-1的药物组与空白对照相比，能明显够降低乙肝表面抗原 (HBsAg)、乙肝e抗原（HBeAg)的表达和抑制乙肝病毒DNA的表达水平，同时，FHP-1显著提 高小鼠巨噬细胞Raw264. 7分泌肿瘤坏死因子TNF-a、白细胞介素IL-6、IL-12及炎症因子 N0,具有显著的抗病毒活性和免疫调节功能，可用于作为预防HBV的药品以及提高机体免 疫功能的食品和保健品。本发明公布的亚麻籽多糖制备方法简单可靠，可大规模生产。 [0074] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种具有抗病毒和免疫活性的亚麻籽多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步 骤： (1) 亚麻籽壳仁分离：亚麻籽经粉碎、过筛后，亚麻籽粉与甘油和乙醇充分混和，离心 20~30min，分别收集上层亚麻籽仁和沉积在底层的亚麻籽壳； (2) 亚麻籽多糖的提取：以步骤（1)获得的亚麻籽壳为原料，微波辅助热水浸提多糖， 提取液过筛，收集浓缩液，真空冷冻干燥； (3) 亚麻籽多糖的分离：将步骤（2)冷冻干燥后的粗提物用Sevage法脱蛋白25~30 次，3500~5000r/min离心20~30min，取上清液；向上清液中加入无水乙醇，静置沉淀4~ 12h，3500~5000r/min离心20~30min，取沉淀，真空冷冻干燥后得到亚麻籽壳粗多糖； (4) 亚麻籽多糖的纯化：将步骤（3)获得的亚麻籽壳粗多糖配成5~8mg/mL溶液，用 层析柱A纯化，水洗并用苯酚硫酸法检测多糖，合并糖反应阳性收集液，50~60°C旋转蒸发 浓缩，透析后真空冷冻干燥；将干燥后的多糖配成2~5mg/mL溶液，用层析柱B纯化，用蒸 馏水洗脱，收集多糖组分，透析，超滤，浓缩、冷冻干燥，得到所述具有抗病毒和免疫活性的 亚麻籽多糖。2. 根据权利要求1所述的一种具有抗病毒和免疫活性的亚麻籽多糖的制备方法，其特 征在于，步骤（1)所述的甘油和乙醇体积比为（15 :3~4)，亚麻籽粉碎后过20目筛。3. 根据权利要求1所述的一种具有抗病毒和免疫活性的亚麻籽多糖的制备方法，其特 征在于，步骤（2)所述的微波辅助热水浸提的条件为：料液比1:20~1:30 (w/v)、浸提温度 60~100°C、浸提时间40~60min、输出功率600~800W、搅拌速度600~900r/min ;微波 辅助热水浸提所得的提取液过100目筛。4. 根据权利要求1所述的一种具有抗病毒和免疫活性的亚麻籽多糖的制备方法，其特 征在于，步骤（3)所述的Sevage试剂的配制方法为将氯仿、正丁醇按体积比3 :1~5 :1混 合。5. 根据权利要求1所述的一种具有抗病毒和免疫活性的亚麻籽多糖的制备方法，其特 征在于，步骤（3)所述的Sevage法脱蛋白的方法具体为：将步骤（2)冷冻干燥后的粗提物 与Sevage试剂按体积比1 :1~1 :3混合，振摇20~30min，3500~5000r/min离心20~ 30min，取出上层溶液，把所得上层溶液重复如下处理过程25~30次：与Sevage试剂按体 积比1 :1~1 :3混合，振摇20~30min，3500~5000r/min离心20~30min，取上层溶液。6. 根据权利要求1所述的一种具有抗病毒和免疫活性的亚麻籽多糖的制备方法，其特 征在于，步骤（3)所述的无水乙醇加入量为亚麻籽壳粗多糖溶液体积的3~5倍，加入无水 乙醇后于4°C下静置沉淀4~12h。7. 根据权利要求1所述的一种具有抗病毒和免疫活性的亚麻籽多糖的制备方法，其特 征在于，步骤（4)所述柱层析A为DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱，所述层析柱B 为Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱；所述超滤过程中所用的膜截留分子量为IX IO6Da ;所述 透析时间为48小时，透析袋截留分子量为3000~5000Da。8. 权利要求1至7任一项所述制备方法获得的具有抗病毒和免疫活性的亚麻籽多 糖，其特征在于，所述亚麻籽硫酸酯多糖组分均一，经凝胶渗透色谱测定其平均分子量为 2626kDa，经衍生化后气相测定发现其主要由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、甘露糖、葡萄 糖和岩藻糖七种单糖组成。9. 根据权利要求8所述的具有抗病毒和免疫活性的亚麻籽多糖，其特征在于，所述亚 麻籽硫酸酯多糖具有三螺旋结构及硫酸酯基团的特殊结构，同时具有抗乙肝病毒和增强免 疫应答的功能。10. 权利要求8所述的具有抗病毒和免疫活性的亚麻籽多糖作为预防乙肝病毒HBV感 染，治疗免疫缺陷或改善免疫力低下的功能性食品的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种具有抗病毒和免疫活性的亚麻籽多糖的制备及其应用。以亚麻籽为原料，经亚麻籽粉碎—壳仁分离—微波辅助热水提取—Sevage法脱蛋白—乙醇沉淀—冷冻干燥得到亚麻籽粗多糖，经过“离子交换柱层析—葡聚糖凝胶柱层析—超滤”制备出亚麻籽硫酸酯多糖。本发明所得的FHP-1组分均一，分子量为2626kDa。本发明首次从亚麻籽中分离到具有硫酸酯和三螺旋结构的多糖。通过细胞生物学实验证明该多糖能够降低乙肝表面抗原、乙肝e抗原的表达和抑制乙肝病毒DNA的复制，能激活免疫应答，提高免疫细胞分泌肿瘤坏死因子TNF-a、白细胞介素IL-6、IL-12及炎症因子NO。
【IPC分类】A61P37/04, A61P31/20, A61K31/715, C08B37/00
【公开号】CN105037573
【申请号】CN201510391862
【发明人】汪勇, 李小凤, 廖文镇, 梁珊, 滕英来
【申请人】暨南大学
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年7月3日