杂交瘤细胞株及其分泌的抗口蹄疫o型病毒的单克隆抗体与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域中的杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体与应用，特别 是设及口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒的单克隆抗体和分泌该抗体的杂交瘤细胞株W 及该抗体在检测口蹄疫0型（〇/Mya98/BY/2010)病毒中的应用。
【背景技术】
[0002] 口蹄疫是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV)感染引起的偶蹄 动物共患的急性、热性、接触性传染病，最易感染的动物是牛、猪、骆驼、羊、鹿等，野猪、野牛 等野生动物也易感染此病。口蹄疫在亚洲、非洲和中东W及南美均有流行，在非流行区也有 散发病例。
[0003] 口蹄疫发病后一般不致死，但会使病兽的口、蹄部出现大量水瘤，高烧不退，使实 际畜产量锐减。另外，有个别口蹄疫病毒的变种可传染给人。因此，每次爆发后只能屠宰和 集体焚毁染病牲畜W绝后患。由于口蹄疫传播迅速、难于防治、补救措施少，被称为畜牧业 的"头号杀手"。我国对口蹄疫的预防主要通过疫苗注射接种，发生口蹄疫的则捕杀。
[0004]FMDV的免疫是依赖T细胞的口蹄疫病毒（FMDV)目前有0、A、C、SATl、SAT2、 SAT3(即南非口蹄疫病毒1、2、3型）和Asial(亚洲1型）7个血清型。各型之间几乎没 有免疫保护力，感染了一型口蹄疫的动物仍可感染另一型口蹄疫病毒而发病，因此常常用 多价疫苗来降低患口蹄疫的风险。FMDV属于小RNA病毒科（Picornaviridae) 口疮病属 (Aphthovirus),是偶蹄类动物高度传染性疾病（口蹄疫）的病原。在病毒的中屯、为一条单 链的正链RNA，由大约8000个碱基组成，是感染和遗传的基础；周围包裹着的蛋白质决定了 病毒的抗原性、免疫性和血清学反应能力；病毒外壳为对称的20面体。口蹄疫0型毒株是 国内流行较广的一类亚型，其中，口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒是口蹄疫0型的一个 毒株。0/Mya98/XJ/2010株由中国兽医药品监察所提供，属于东南亚拓扑型（SEA)Mya-98谱 系，该毒株在BHK21细胞上遗传稳定，免疫原性好，疫苗的交叉保护性高，每毫升抗原表达 量可达2微克W上，每毫升TCI^。可达10 7'5W上。
[0005] 疫苗接种是特异性预防FMDV的可靠和有效手段，安全有效的疫苗是成功预防、控 制乃至最终消灭FMDV的先决条件。FMDV弱毒疫苗和灭活疫苗等常规疫苗都具有良好的免 疫原性，在预防和控制FMDV的过程中发挥着重要作用。随着分子生物学技术的飞速发展， FMDV基因工程疫苗如亚单位疫苗、可饲疫苗、合成肤疫苗、蛋白质载体疫苗、基因缺失疫苗、 活载体疫苗、核酸疫苗等不断涌现。目前，常见的是口蹄疫多种毒株制备的多价疫苗，如口 蹄疫0型（0/GX/09-7)和口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)混合制备成的双组份疫苗。疫苗 生产企业目前常采用薦糖密度梯度离屯、法测量口蹄疫病毒的含量，但是无法对多组份疫苗 的某种毒株进行单独定量。
[0006] 基于抗原抗体的免疫学检测，因操作简单、灵敏度高、特异性强、仪器设备便宜等 优点已经被广泛使用在临床检测上。目前，市场上偶见能够检测口蹄疫抗原的酶联免疫 检测试剂盒，但是大都采用了多克隆抗体制成，如中国农业科学院兰州兽医研究所开发、 生产的O型口蹄疫146S抗原定量化ISA检测试剂盒，该试剂盒已经申报专利（申请公布 号CN103076451A)，该试剂盒采用了O型口蹄疫的兔抗血清和豚鼠抗血清两种多克隆抗体 制成，但是无法区分O型的不同毒株，如细甸98株（0/Mya98/BY/2010株）和广西株（0/ GX/09-7株），因而就无法对多组份0型疫苗中的每种0型口蹄疫146S抗原进行单独定量， 其主要的原因就在于多克隆抗体针对多种抗原表位，而不同的血清型尤其是同一血清型的 不同毒株之间存在相同的抗原表位。因此，采用多克隆抗体去特异性检测口蹄疫不同的毒 株是不可能成功的，尤其是同一血清型不同的毒株。
[0007] 单克隆抗体因其针对的抗原位点单一，特异性较好，并且生产的重复性优于多克 隆抗体，目前在很多临床检测中被采用。国内偶见有制备口蹄疫单克隆抗体的研究，但尚未 见到用于特异性检测口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒的单克隆抗体的报道。
【发明内容】
[0008] 本发明的第一个目的是提供用于检测口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒的杂交 瘤细胞株及其产生的单克隆抗体。
[0009] 本发明W口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒为免疫原免疫小鼠，获得持续、稳定 分泌抗口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，名称为1F2,该 细胞株已于2015年06月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，保 藏编号为CGMCCNo. 10896。
[0010] 由杂交瘤细胞株1F2分泌的单克隆抗体命名为lF2anti，来源于小鼠属小鼠（Mus mus州Ius)，也属于本发明的保护范围。
[0011] lF2anti的重链可变区具有序列表中的SEQIDNo:1的氨基酸残基序列或将序列 表中SEQIDNo:1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可与 口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒特异结合的多肤，轻链可变区具有序列表中的SEQID No: 2的氨基酸残基序列或将序列表中SEQIDNo: 2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基 酸残基的取代、缺失或添加且可与口蹄疫0型（〇/Mya98/BY/2010)病毒特异结合的多肤。
[0012] 序列表中的SEQIDNo:1由113个氨基酸残基组成，序列表中的SEQIDNo:2由 98个氨基酸残基组成。
[0013]编码单克隆抗体lF2anti的基因（lF2anti)，其重链可变区编码基因具有序列表 中SEQIDNo:3的DNA序列或编码序列表中SEQIDNo:1的DNA序列或在高严谨条件下可 与序列表中SEQIDNo:3限定的DNA序列杂交的核巧酸序列，其轻链可变区编码基因具有 序列表中SEQIDNo:4的DNA序列或编码序列表中SEQIDNo:2的DNA序列或在高严谨条 件下可与序列表中SEQIDNo:4限定的DNA序列杂交的核巧酸序列；
[0014] 所述高严谨条件为在0.IXSS阳（或0. 1XSSC)、0. 1%SDS的溶液中，65°C条件下 杂交并洗膜。
[0015] 序列表中的SEQIDNo:3由339个碱基组成，编码具有序列表中SEQIDNo:1的 氨基酸残基序列的蛋白质，序列表中的SEQIDNo:4由294个碱基组成，编码具有序列表中 SEQIDNo:2的氨基酸残基序列的蛋白质。
[0016] 含有本发明基因lF2anti的表达载体、转基因细胞系和宿主菌均属于本发明的保 护范围。
[0017] 扩增本发明基因lF2anti中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
[0018] 获得本发明的杂交瘤细胞株1F2的方法，可包括W下步骤：
[0019] 1)用口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒作为免疫原免疫动物；
[0020] 2)分离免疫动物的脾细胞，将其与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤；
[0021] 3)筛选杂交瘤细胞，得到杂交瘤细胞株1F2。
[0022] 获得本发明单克隆抗体lF2anti的方法，在上述步骤的基础上增加W下步骤：
[0023] 4)从杂交瘤细胞株1F2的培养液或接种杂交瘤细胞株1F2的动物的腹水液中分离 并纯化出单克隆抗体lF2anti。
[0024] 在上述方法中，步骤1)中的口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒可为活病毒或灭 活病毒，优选为灭活病毒，浓度为10-1000 y g/mL;用于制备单克隆抗体的免疫动物可为小 鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、猪、驴、马等哺乳动物，优选为小鼠。
[00巧]步骤2)中当被免疫动物的血清抗体水平达到峰值时，可分离动物的脾细胞并制 备成单细胞悬液。必要时，可使用免疫吸附方法筛选脾细胞，并在适当的融合剂（如聚乙二 醇）的诱导下与骨髓瘤细胞（优选为小鼠骨髓瘤细胞SP2/0)融合W形成杂交瘤。
[0026] 步骤3)中可W在选择性培养基（如HAT培养基）中培养W筛选融合的杂交瘤细 胞，并进一步可使用流式细胞术、Western印迹法、免疫沉淀法等方法鉴定所需的阳性抗性 细胞株。
[0027] 步骤4)中可于体外（如在组织培养瓶或多孔纤维反应器中）或体内（小鼠腹水） 培养分泌口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒单克隆抗体lF2anti的杂交瘤细胞株1F2,并 从细胞培养液或小鼠腹水液中收集和纯化出单克隆抗体lF2anti。
[0028] 本发明的第二个目的是提供一种单克隆抗体lF2anti的应用，提出口蹄疫0型（0/ Mya98/BY/2010)病毒的化ISA检测方法，该检测是用口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒 的单克隆抗体lF2anti作为包被抗体及酶标抗体的双抗夹屯、化ISA检测方法。
[0029] 具体来讲，所述双抗夹屯、ELISA检测，可包括W下步骤：
[0030] 1)用单克隆抗体lF2anti包被酶联板，封闭经包被的酶联板；
[0031] 2)加待测样品，洗板；
[0032] 3)加辣根过氧化物酶（HR巧或碱性憐酸醋酶（AL巧标记的单克隆抗体lF2anti， 洗板；
[003引 4)加底物显色；
[0034]W终止反应；
[00对 6)测定004加值。
[0036] 上述检测方法中的反应条件及试剂均可按照常规方法进行选择。
[0037] 步骤3)中单克隆抗体lF2anti的标记酶优选为辣根过氧化物酶，可通过戊二醒法 或过舰酸法将酶交联在单克隆抗体lF2anti上。
[0038] 本发明的第S个目的是提供一种检测口蹄疫0型（0/Mya98/BY