一、用单克隆抗体lF2anti及化ISA双抗体夹屯、法检测不同浓度的口蹄疫0型（0/ Mya98/BY/2010)病毒
[0125] 有文献（NumberandmolecularweightsofFood-and-MouthDiseaseVirus CapsidProteinsandtheEffectsofMaleylation,JournalofVirology, 1971,Vol7,No .2，P250-259)记载，口蹄疫病毒的膜蛋白（VP1、VP2、VP3和VP4)具有多个拷贝，因此本发明 W单克隆抗体lF2anti既为包被抗体又为标记抗体来特异性的检测口蹄疫0型（0/Mya98/ BY/2010)病毒。
[0126] 用单克隆抗体巧2曰11^及化154双抗体夹屯、法检测口蹄疫0型（0/%^98/ BY/2010)病毒，检测方法包括W下步骤：
[0127] 1)包被微孔板：将单克隆抗体lF2anti用抑7. 0-7. 410mMPBS缓冲溶液稀释成 4yg/mU在酶标板的每孔加110yL4°C下包被过夜；倾去包被液，拍干，然后在每孔中加 入300yL1%BSA(在抑7. 0-7. 410mMPBS缓冲溶液中），放入4°C封闭过夜后，拍干，干 燥，真空包装后备用。
[0128] 2)酶标记抗体：采用过舰酸钢法用辣根过氧化物酶（HR巧标记单克隆抗体 lF2anti，具体方法为：称取3mgHRP溶解于ImL蒸馈水中。于上液中加入0. 12mL新配的 0.IM化1〇4溶液，室溫下避光揽拌20分钟。将上述溶液装入透析袋中，对ImMpH4. 4的醋酸 钢缓冲液透析，4°C过夜。加30y1 0. 2MpH9. 5碳酸盐缓冲液，使透析后的HRP的pH升高到 9. 0-9. 5,然后立即加入溶解在1血0.OlM碳酸盐缓冲液中的4mgIgG,室溫避光轻轻揽拌2 小时。加0. 12血新配的5mg/mLNaBH4溶液，混匀，再置4°C2小时。将上述溶液装入透析袋 中，对0.OlM抑7. 2PBS透析，4°C过夜。取出后加入等体积优质甘油，分装，-20°C保存，即为 1F2-HRP。用酶标记抗体稀释液按照一定比例稀释即为酶标记抗体工作液。酶标记抗体稀释 液的配方为：化2册〇4.12&0,2. 9g;胞&口〇4.2&0,0. 296g;化Cl，8. 5g;Proclin300,0. 6血； BSA，IOg;胎牛血清，150血；酶稳定剂，5g;Tween-200. 25mL;双蒸水，定溶至1000 mL;调整 抑至 7. 6-7. 8。
[0129] 3)与待检样品反应：向酶标板中分别加入口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒梯 度稀释液100yL/孔，病毒浓度见表3,37°C溫育1小时。
[0130] 4)洗板并加入酶标记抗体：用PBST洗液（配方：胞2册〇4 ? 12&0 58g，胞&?〇4.2&0 5. 92g，化Cl170g，Tween-205.O血，Proclin3000. 6血，用双蒸水定溶至1000血，调整抑值 至7. 2-7. 4 ;使用前用双蒸水稀释20倍）洗板5次后，再加入1F2-HRPQ: 1000-1:8000稀 释）100yL/孔，37°C溫育0. 5小时。
[013。 5)洗板与显色：用PBST洗板5次后加入显色液A(配方为：无水乙酸钢4. 5g，冰 醋酸1. 2血，过氧化脈0. 8g，用双蒸水定溶至1000血。）、显色液B(配方为：巧樣酸1. 62邑， 邸TA-2化0. 372g，甘油100血，四甲基联苯胺盐酸盐0. 50g，用双蒸水定溶至1000血。）各 50yL/孔进行显色，37°C溫育15min。
[0132] 6)终止反应与测量：加入终止液（配方为：1000血双蒸水中含有98 %硫酸 27. 8血。），50yL/孔，读数 0〇4加。
[0133] 检测结果如表4所示，可W看出该试剂盒能够检测15. 6-500ng/mL范围的抗原，在 该区间内线性满足需要，表明该试剂盒具有良好的线性。
[0134] 表4用单克隆抗体lF2anti及化ISA双抗体夹屯、法检测口蹄疫0型（0/Mya98/ BY/2010)病毒的结果
[0136] 二、用单克隆抗体lF2anti及化ISA双抗体夹屯、法检测口蹄疫0型（0/Mya98/ BY/2010)病毒的灵敏度检测
[0137] 用单克隆抗体lF2anti及化ISA双抗体夹屯、法检测不同浓度的口蹄疫0型（0/ Mya98/BY/2010)病毒，W确定检测方法的灵敏度，检测方法与步骤一相同。
[0138] 不同浓度口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒的检测结果如表4所示，灵敏度的 拟合曲线如图4(横坐标表示W10为底的浓度的对数，纵坐标表示W10为底的OD值的对 数）所示，可W看出能够将15. 6ng/mL的抗原与阴性对照区分开伽值是阴性对照的2倍 W上），而7.Sng/血的OD值与阴性对照区分不大，因此判断该试剂盒的检测灵敏度可达 15. 6ng/mU表明该试剂盒具有较高的灵敏度。
[0139] S、用单克隆抗体lF2anti及化ISA双抗体夹屯、法检测口蹄疫0型（0/Mya98/ BY/2010)病毒的特异性检测
[0140] 用单克隆抗体巧2曰11^及化154双抗体夹屯、法检测口蹄疫0型（0/%曰98/ BY/2010)病毒、口蹄疫 0 型（0/GX/09-7)、亚洲 1 型（J化/06)和A型（Re-A/WH/09)病 毒（病毒均用样品稀释液稀释成4000ng/mL(样品稀释液配方：胞2册〇4? 12&0, 2. 9g; 胞&口〇4.2&0,0. 296g;化Cl，8. 5g;Proclin300,0. 6mL;BSA，IOg;胎牛血清，150mL;硫酸庆 大霉素，2支（8万单位/支）；双蒸水，定溶至1000血；调整抑至7. 6-7. 8。过滤除菌，2-8°C 保存），W确定检测方法的特异性，检测方法与步骤一相同。
[014。 口蹄疫0型（0/GX/09-7)、亚洲1型（J化/06)和A型巧e-A/WH/09)病毒检测结 果呈阴性，无交叉反应，口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒检测结果呈阳性，说明W单克 隆抗体lF2anti同时为包被抗体和标记抗体，采用化ISA双抗体夹屯、法能够特异性地识别 口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒，与口蹄疫0型（0/GX/09-7)、亚洲1型（J化/06)和A 型巧e-A/WH/09)病毒等其它病毒无任何反应。
[0142] 四、制备用ELISA双抗体夹屯、法检测口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒的试剂 盒
[0143] W单克隆抗体lF2anti作为包被抗体和标记抗体，用化ISA双抗体夹屯、法检测口 蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒的试剂盒包括W下试剂：
[0144] 1)预包被微孔板：预先用单克隆抗体lF2anti按照4yg/mL的浓度预先包被、封 闭，并密封保存在真空侣锥袋中，每个试剂盒一块96孔的微孔板；
[0145] 2)酶标记抗体工作液：预先用辣根过氧化物酶（HR巧或碱性憐酸醋酶（AL巧标记 的lF2anti抗体，并用酶标记抗体稀释液稀释成合适浓度作为工作液，通常为0. 1-1. 0yg/ mL，每个试剂盒10.OmL。
[0146] 酶标记抗体稀释液配方为：胞2册〇4 ? 12&0,2. 9g;胞&口〇4 ? 2&0,0. 296g;化Cl， 8. 5g;Proclin300,0. 6血巧SA，IOg;胎牛血清，150血；酶稳定剂（购自上海西宝生物科技 有限公司），5g;Tween-200. 25血；双蒸水，定溶至1000血；调整抑至7. 6-7. 8。
[0147] 3)稀释液：用于标准品和待测样品的稀释，其配方为胞2册〇4?12&0, 2. 9g; 胞&口〇4.2&0,0. 296g;化Cl，8. 5g;Proclin300,0. 6mL;BSA，IOg;胎牛血清，150mL;硫酸庆 大霉素，2支（8万单位/支）；双蒸水，定溶至1000血；调整抑至7. 6-7. 8。过滤除菌，2-8°C 保存。每个试剂盒1瓶，25mL/瓶。
[014引 4)洗涂液：为20倍的浓缩洗液，用前稀释。其配方为：胞2册04 ? 12&0 58g， NaHzPO* ? 2&0 5. 92g，化Cl170g，Tween-205. 0血，Proclin3000. 6血，用双蒸水定溶至 1000血，调整抑值至7. 2-7. 4。每个试剂盒1瓶，25血/瓶。
[014引 W显色液A:每个试剂盒1瓶，7血/瓶。配方为：无水乙酸钢4. 5g，冰醋酸1. 2血， 过氧化脈0. 8g，用双蒸水定溶至lOOOmL。
[0150] 6)显色液B:每个试剂盒1瓶，7血/瓶。显色液B配方为：巧樣酸1. 62g， 邸TA-2化0. 372g，甘油100血，四甲基联苯胺盐酸盐0. 50g，用双蒸水定溶至1000血。
[0151] 8)终止液：每个试剂盒1瓶，7血/瓶。配方为：1000血双蒸水中含有98 %硫酸 27.anL。
[0152] 9)标准口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒阳性血清：每个试剂盒1瓶，1血/瓶。 [015引10)标准口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒阴性血清：样品稀释液可作为阴性 血清使用。
[0154] 实施例4、用单克隆抗体lF2anti制备的金标纸层析测试卡检测口蹄疫0型（0/ Mya98/BY/2010)病毒
[0155] 1、制备金标纸层析试纸
[0156] 如图5、6所示（图中5为金标纸正面结构图，图中6为金标纸层析试纸的纵截面 结构图），用于检测口蹄疫0型（〇/Mya98/BY/2010)病毒的金标纸层析试纸由吸水垫1、硝 酸纤维素膜（NC膜）2、玻璃纤维膜样品垫3、玻璃纤维素膜结合物释放垫4组成，硝酸纤维 素膜2上设有检测线灯线）6和质控线（C线）5。<