100iiL最后测 定450nmOD值，W0〇45。值大于阴性对照2倍为阳性判断依据。
[0076] 对所得阳性克隆株采用有限稀释法进行亚克隆，具体方法是：
[0077] 1)取出抗体阳性孔细胞，用HT培养液制成细胞悬液。并取样进行台吩兰染色，计 数。
[0078] 2)用HT培养液将细胞稀释成200个/mU40个/mU20个/mL和的悬液。
[0079] 3)用吸管将细胞悬液分别种入微量培养板，每孔0. 05mU细胞含量分别为10个/ 孔、2个/孔、1个/孔和0.5个/孔。
[0080] 4) 5 %C02 饱和湿度，37°C培养。
[0081] 5)每天用倒置显微镜观察克隆生长情况，选择只有一个集落生长的孔，弃掉两个 W上和没有细胞生长的孔。
[008引 6)克隆大量繁殖后，布满孔底的1/3-1/2时，通过间接ELISA法测培养液上清抗 体，选择阳性克隆，并传4-6代就可W建成克隆株。
[0083] 3、杂交瘤细胞的获得
[0084] 重复步骤2,进行2次细胞融合，经过4次亚克隆和间接ELISA筛选，得到5株针对 口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒可稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，并根据克隆产 生位置分别编号为1F2、2B4、5C3、4H9、7巧。
[0085] 4、杂交瘤细胞所得单抗的性能检测
[0086] 1)细胞培养液上清效价测定：用间接ELISA法（方法见步骤2)检测上述杂交瘤 细胞培养上清的效价，结果如表1所示，效价为：1:10-1:120,表明培养上清中均含有目标 抗体，其中2B4抗体效价略低。
[0087] 表1杂交瘤细胞培养上清的效价
[0089] 2)小鼠腹水效价测定：用间接ELISA法（方法见步骤2)检测上述杂交瘤细胞制 备的腹水效价，结果如表2所示，效价为：1:1000-1:1000000,表明小鼠腹水中均产生了目 标抗体，抗体效价除2B4外其余4种均满足需要。
[0090] 表2杂交瘤细胞腹水的效价
[0092] 3)小鼠腹水抗体特异性验证：用间接化ISA法（方法见步骤2)检测上述杂交瘤 细胞制备的腹水的特异性，即分别采用口蹄疫不同的毒株包被微孔板，将腹水用抑7. 410mM PBS稀释100倍后检测。结果如表3所示，其中特异性抗体为1F2和2B4克隆，另外S种为 非特异性抗体。由于2B4克隆抗体效价较低，故选择1F2抗体用于ELISA试剂盒和胶体金 检测试剂的开发和制备
[0093] 表3杂交瘤细胞培养上清的效价
[0094]
[0095] 5、杂交瘤细胞的传代培养
[0096] 将1F2杂交瘤细胞在含有10%胎牛血清的RPMI-1640(含有lOOU/mL青霉素和 100yg/mL链霉素）中继续进行培养、传代，培养到第10代后，杂交瘤细胞株1F2仍然能够 生长良好、稳定传代，培养液上清效价仍然可W达到1:50W上，表明获得了能够稳定传代， 并可W持续、稳定分泌抗口蹄疫0型（〇/Mya98/BY/2010)病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞。
[0097] 6、保存杂交瘤细胞
[0098] 获得持续、稳定分泌抗口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒的单克隆抗体的杂交 瘤细胞后，必须保存一部分杂交瘤细胞，运是因为在连续传代的过程中，可能产生突变或染 色体的漂移W至丧失固有特性或丢失产生抗体的特性；另外，在长期的培养过程中，难免不 发生污染W至于毁灭。
[0099] 保存方法包括W下步骤：
[0100] 1)去掉细胞培养瓶中旧的培养液，加入含有10%胎牛血清的RPM1640培养基，使 细胞悬浮。
[010。 2) 10(K)r/min离屯、lOmin，去上清。细胞沉淀用细胞冻存液（二甲基亚讽：胎牛血 清：RPM1640 = 1 :2 :7)复溶制成悬液，浓度5.OXIO5细胞/血。
[0102] 3)取样，台吩兰染色，计数活细胞，应在95%W上。具体地：
[0103] 称取4g台吩蓝，加少量蒸馈水研磨，加双蒸水至IOOmU用滤纸过滤，4度保存。使 用时，用pH7.410mMPBS稀释至0.4%。制备单细胞悬液，并作适当稀释。将细胞悬液与 0. 4%台吩蓝溶液W9:1混合混匀（终浓度0. 04% )。在=分钟内，镜下观察，死细胞被染 成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状。计算活细胞率（％)=活细胞总数/(活细胞 总数+死细胞总数）X100 %。
[0104] 4)将细胞无菌分装至1.8血细胞冻存管（购自浙江拱东医疗科技有限公司），每 瓶0. 5血-1. 0血，梓紧瓶盖。
[0105] 5)细胞冻存：4°C放置2小时，然后-20°C再放置2小时，之后液氮罐气态部分 (-70°C)放置2小时，最后转入液氮长期保存。
[0106] 按W上方法，W口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒为免疫原免疫小鼠，获得了持 续、稳定分泌抗口蹄疫0型（〇/Mya98/BY/2010)病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，名称为 1F2。该细胞株已于2015年06月23日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中屯、，保藏编号为CGMCCNo. 10896。
[0107] 实施例2、大量制备抗口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒的单克隆抗体 [010引一、单克隆抗体的大量制备及纯化
[0109] 1、采用动物体内诱生单克隆抗体法大量制备单抗：选择成年BALB/c小鼠，腹 腔接种降植烧，每只小鼠0. 5mL。7-10天后腹腔接种第16代杂交瘤细胞1F2,每只小鼠 2Xl〇e-3XIO6个。间隔5天后，待腹部明显膨大，W手触摸时，皮肤有紧张感，即可用9号 针头采集腹水。
[0110] 2、抗体纯化：将腹水离屯、（1000化/min30分钟），除去细胞成分和其它的沉淀物， 收集上清。将上清用15-30倍体积的抑7. 0-7. 610mMPBS(配方：NaH2P〇4 ? 2&00. 296g， 胞2册〇4? 12&0 2. 9g，双蒸水定溶至1000血，测定抑值为7. 2-7. 4)稀释，用ProteinA 亲和层析柱（GE公司，货号为29-0491-04)进行亲和纯化，上柱液为抑7. 0-7. 610mM的 PBS缓冲液，柱层析洗脱液为抑3. 5100ml的巧樣酸缓冲液（配方：一水巧樣酸21g加入 1000血去离子水中，用5M化OH或4M肥1调整抑值至3. 5)，洗脱下来的抗体尽快用IM pH9.STris-HCl调整抑值至中性，得到抗口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒的单克隆抗 体，命名为lF2anti。
[0111] 二、抗体鉴定
[0112] 1、抗体纯度鉴定
[0113] 对抗口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒的单克隆抗体lF2anti进行纯度8% SDS-PAGE电泳鉴定。
[0114] 结果如图1(泳道1F2为单克隆抗体lF2anti，泳道M为蛋白分子量标准（kDa))所 示，无明显杂带，单克隆抗体lF2anti的纯度在85%W上，表明该纯度良好，可W满足需求。
[0115] 2、抗体构象型表位验证
[0116] 常规WesternBlot检测方法检测抗口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒的单克 隆抗体lF2anti所针对的表位是构象型（表示该抗体针对的抗原位点为空间结构）还是线 性（表示该抗体针对的抗原位点为线性结构），方法为：使用150yg灭活口蹄疫0型（0/ Mya98/BY/2010)病毒进行还原性8%SDS-PAGE电泳，湿转法转至PVDF膜上，使用纯化的单 克隆抗体lF2anti进行WesternBlot杂交检测。
[0117] 结果如图2所示，其中M为蛋白分子量标准（kDa),泳道3和4为单克隆抗体 lF2anti，泳道1、2和5为阳性对照（具体为在单克隆抗体制备过程中产生免疫小鼠的阳性 尾血，属于多克隆抗体，见实施例1)，从该图看出，单克隆抗体lF2anti为构象型表位。
[0118] 3、抗体类及亚类鉴定
[0119] 采用间接化ISA法，使用抗小鼠各种Ig亚型的抗体鉴定杂交瘤细胞1F2分泌的抗 口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒的单克隆抗体lF2anti的Ig亚型。
[0120] 结果如图3所示，单克隆抗体lF2anti为IgGl。
[0121] S、单克隆抗体lF2anti的可变区序列测定
[0122] 提取杂交瘤细胞1F2的mRNA，反转录为cDNA，使用可变区通用引物进行高保真PCR 扩增，将PCR扩增片段插入到T载体内进行DNA序列测定。DNA序列测定结果：编码单克隆 抗体lF2anti的基因（lF2anti)，其重链可变区编码基因具有序列表中SEQIDNo:3的DNA 序列或编码序列表中SEQIDNo:1的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQIDNo: 3限定的DNA序列杂交的核巧酸序列，其轻链可变区编码基因具有序列表中SEQIDNo:4 的DNA序列或编码序列表中SEQIDNo:2的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ IDNo:4限定的DNA序列杂交的核巧酸序列。将获得的DNA序列翻译成蛋白质的氨基酸序 列。lF2anti的重链可变区具有序列表中的SEQIDNo:1的氨基酸残基序列或将序列表中 SEQIDNo:1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可与口蹄 疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒特异结合的多肤，轻链可变区具有序列表中的SEQIDNo: 2的氨基酸残基序列或将序列表中SEQIDNo:2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残 基的取代、缺失或添加且可与口蹄疫0型（〇/Mya98/BY/2010)病毒特异结合的多肤。上述 序列在NCBI数据库进行比对后未显示有相同序列。
[0123] 实施例3、用单克隆抗体lF2anti及化ISA双抗体夹屯、法检测口蹄疫0型（0/ Mya98/BY/2010)病毒
[0124]