用于检测蛋白质和核酸的纳米孔生物传感器的制造方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基于修饰的溶细胞素蛋白质的纳米孔生物传感器。所述纳米孔生物传 感器容纳大分子，所述大分子包括折叠的蛋白质和核酸，所述核酸包括双链（ds)DNA，所述 纳米孔生物传感器与其他纳米孔生物传感器相比，显示出增强的活性，溶解性和电性质。
【背景技术】
[0002] 离子或分子穿过生物膜的运输是细胞生命的基本过程，且所述运输被离子通 道，转运蛋白（transporter)和孔紧密地调节。最近，研究者在单分子分析中采用生物 的，1固态的， 2DNA折纸3和混合的3a'b'4纳米孔。5生物纳米孔与它们的合成对应物相比 具有优势，主要是因为它们可以重复制造并以人工纳米孔无法匹敌的原子水平精度修 饰。然而，生物纳米孔仍有缺点。生物纳米孔的机械稳定性取决于具体情况。来自金黄 色葡萄球菌（Staphylococcusaureus)的α溶血素（aHL)纳米孔和来自耻垢分枝杆菌 (Mycobacteriumsmegmatis)的孔蛋白A(MspA)纳米孔在脂类双分子层中在高施加电势下 保持打开，而且令人惊讶的是能很好地对抗温度，6pH6M和变性剂浓度的极端条件。&'8然 而，多数其他孔蛋白和通道不太牢固。然而，可认为地，生物纳米孔最大的不利条件是其固 定的尺寸。例如，aHL，MspA或气单胞菌溶素纳米孔的尺寸允许对单链核酸、适配子或小肽 进行分析，9但是它们较小的内直径（~lnm)妨碍了对其他重要生物系统例如折叠的酶或 核酶的直接研究。
[0003] 最近大量的研究对折叠蛋白质迀移穿过人工纳米孔进行了采样。w然而，对具有固 态纳米孔的蛋白质的研究是困难的，因为蛋白质具有不均匀的电荷分布，它们经常吸附到 纳米孔表面而且它们太快迀移而不能合适地取样。&进一步地，由于蛋白质具有紧密折叠 结构，纳米孔的直径应该与蛋白质的直径相似。最近，我们已经介绍了作为第一生物纳米 孔的来自伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphi)的溶细胞素A(ClyA)，其能够对天然折叠蛋白 质进行研究。7aClyA结构对于这项任务是理想的，因为蛋白质例如凝血酶（37kDa)或苹果 酸脱氢酶（二聚体，35kDa单体）可在宽的顺式入口（5.5nm，表1)和窄的反式出口（3.3nm， 表1)之间被电泳捕获，并可因此采样若干分钟。因为离子电流穿过ClyA对于前庭环境非 常敏感，因此人和牛的凝血酶的阻断可以非常容易被识别。7a我们的工作是基于ClyA结构， 所述ClyA结构中，ClyA-WT(C87和C285)的两个天然半胱氨酸残基被丝氨酸（ClyA-SS)取 代。7a然而，当与ClyA-WT单体相比时，ClyA-SS单体显示低的水溶解性和低活性（图S1)， 且在施加的电势高于+60mV或低于-90mV时，ClyA-SS单体在平面脂类双分子层中自发地 打开和关闭（门控（gated))。
[0004] 因此，现有技术中仍需要具有对目标分析物的高灵敏度和在电势范围内具有高水 溶性和稳定性的纳米孔生物传感器。所述纳米孔生物传感器应具有良好的寡聚性、电压依 赖型门控性和在单通道电流记录中的电噪音性能。本发明涉及工程纳米孔，与ClyA-WT和 ClyA-SS相比，在所述纳米孔中对天然半胱氨酸残基和其他残基的特定取代赋予了其额外 的性质。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个方面涉及包含多个亚基的修饰的ClyA孔，其中每个亚基包含由与 SEQIDN0:1至少80%相同的氨基酸序列表示的多肽，其中精确地只有一个Cys残基被Ser取代。在一些实施方式中，Cys残基是C285。在某些实施方式中，修饰的ClyA孔的每个亚 基包括至少一个额外的选自L99Q，E103G，F166Y和K294R的氨基酸取代基。例如，每个亚基 可以包含由SEQIDN0:2的氨基酸序列表示的多肽。在某些实施方式中，在每个亚基中精 确地只有一个Cys残基被Ala取代。在一些实施方式中，修饰的ClyA孔的每个亚基包括 至少一个额外的选自L203V和H207Y的氨基酸取代基。例如，每个亚基可以包含由SEQID NO:3的氨基酸序列表示的多肽。
[0006] 在一些实施方式中，修饰的ClyA孔包含至少12个亚基。例如，修饰的ClyA孔可 以包含12个亚基或者可以包含13个亚基。在某些实施方式中，修饰的ClyA孔具有至少 3. 5nm的顺式直径。在某些实施方式中，修饰的ClyA孔具有至少6nm的反式直径。在一些 实施方式中，当穿过修饰的ClyA孔的电压范围从-60+90到-150mV时，修饰的ClyA孔保持 打开。
[0007] 在一些实施方式中，蛋白质分析物结合到修饰的ClyA孔的内腔中。蛋白质分析物 可以结合到修饰的ClyA孔的内腔中的多于一个的位点。在一些实施方式中，蛋白质分析物 是一种具有15_70kDa分子量范围的蛋白质。
【附图说明】
[0008] 图1显示了由来自大肠杆菌ClyA结构的同源建模构造的伤寒沙门氏菌ClyA纳米 孔（PDB:2WCD，90%序列同一性）的条带代表图。17在图la中，1个原体突出显示，其次级 结构元素从N至C端用深灰色遮蔽，其它原体以浅灰色交替显示。通过定向进化实验改变 的氨基酸的侧链以球形展示。两个天然半胱氨酸残基和苯丙氨酸166被标记。图lb表明 了ClyA-SS、ClyA-CS和ClyA-AS相对于ClyA-WT的序列变化。
[0009] 图2显示了ClyA-WT，ClyA-SS和进化的ClyA变体的寡聚化和纳米孔的形成。图 2a显示了ClyA纳米孔的寡聚，所述寡聚通过4-20%的BN-PAGE检测。蛋白质（lmg/ml)在 负载到凝胶中之前用0.5%DDM在室温预孵化30分钟（40μg/泳道）。泳道1:蛋白质梯 度，泳道 2:ClyA-WT，泳道 3:ClyA-SS，泳道 4:ClyA-AS，泳道 5:ClyA-CS。图lb显示了单一 的纳米孔电导分布，其是由ClyA-WT纳米孔（顶部），ClyA-CS纳米孔（中间）和ClyA-AS 纳米孔（底部）在〇. 5%DDM中预寡聚之后的平面脂质双分子层中重新构成的100个纳米 孔获得。在_35mV，15mMTris.(三羟甲基氨基甲烷）HCl，pH7. 5, 150mMNaCl中进行记录， 温度为28°C。
[0010] 图3显示了 62个ClyA-CS纳米孔的单一电导，所述纳米孔是从在4-20 %丙烯酰胺 BN-PAGE上分离的ClyA-CS的最低（图3a)，第二最低（图3b)和第三最低（图3c)的寡聚 带中提取出的。ClyA-CS单体在0. 5%DDM中预孵化并负载到图2所描述的BN-PAGE上。切 除的带被方框框住并在插图上用箭头标注。在_35mV，28°C的pH= 7. 5的包含150mMNaCl 的15mMTris.HCl中进行记录。
[0011] 图4显示了在三种类型的ClyA-CS纳米孔上由HT引发的电流阻塞。在图4a中，从 左到右，穿过I型，II型和III型ClyA纳米孔（灰色），各所述纳米孔的前庭中包含HT(黑）。II型和III型ClyA纳米孔如在补充信息中所述的被建模为13聚体（13mer) (II型）或14 聚体（III型）。图4b显示了 -35mV时对I型（左），II型（中）或III型（右）ClyA-CS 纳米孔的HT阻塞。对I型和II型ClyA-CS的HT电流阻塞在LI(IRES%分别=56± 1和 68±1)和L2(IRES%分别=23±3和31±1)电流水平之间切换。阻塞持续若干分钟，所以 只显示第一秒的电流轨迹。在I型ClyA-CS中，L1最具代表性的电流阻塞（70% )，而在II 型ClyA-CS中，L2占大多数（96% )。对于III型ClyA-CS纳米孔的HT电流阻塞只显示L2 电流水平（IRES= 32±9)。在-35mV，15mMTris.HC1,pH= 7. 5, 150mMNaCl中进行记录。 应用2000Hz截止值的贝塞尔低通滤波器（Bessellow-passfilter)进行图4b的收集并 在10kHz采样，温度为28°C。
[0012] 图5显示了蛋白质穿过I型和II型ClyA-CS纳米孔的迀移。图5a显示了针对I 型（空心圆圈）和II型（填充矩形）ClyA-CS纳米孔所确定的HT阻塞停留时间的电压依 赖性。由至少50个阻塞的停留时间建立累积分布（ηS3)的单指数拟合计算在各电压下 的寿命。线表示对实验点的双指数拟合。图5b显示了在-150mV对于I型（左）和II型 (右）ClyA-CS纳米孔的HT电流阻塞。所述阻塞只显示两种纳米孔的L2电流水平（对I型 和II型ClyA-CS，分别为IRES%= 23±2 和 31±5)。图 5c显示了在-150mV，I型ClyA-CS 的典型HT电流阻塞，其显示出"肩值"和"尖值"的电流特征。在20nMHT存在下在15mM Tris.HCl、pH= 7. 5、150mMNaCl中进行记录。应用2000Hz截止值的贝塞尔低通滤波器进 行图5b中轨迹的收集，并在10kHz采样。应用10Hz截止值的贝塞尔低通滤波器收集C中 的轨迹，并在50kHz采样。温度是28°C。误差以标准偏差给出。
[0013] 图6显示了纯化的ClyA单体的表征。a)通过4-20%的丙烯酰胺BN-PAGE检测纯 化的ClyA单体的溶解度。各等量份（40μg)的纯化的ClyA单体（无洗涤剂）用约10% 甘油和1倍的天然PAGETM电泳缓冲液（lxofNativePAGETMRunningBuffer)和1倍 的阴极缓冲液添加剂（InvitrogenTM)进行补充并被加载到各泳道：泳道1:标记物，泳道 2:ClyA-WT，泳道 3:ClyA-SS，泳道 4:ClyA-CS，泳道 5:ClyA-AS。b)ClyA变体的过量表达。 各等量份的细菌颗粒进行重悬浮，至约l〇〇mg/mL的浓度并通过超声处理进行分裂，然后在 20000g离心10分钟（4°C)，所述细菌颗粒来源于超量表达ClyA变体的过夜培养物。20μL 含有ClyA蛋白质的可溶片段（fraction)的上清液被加载到12%的丙稀酰胺SDS-PAGE的 泳道 2,4,6,8 上。通过添加包含 15mMTris.HCl、pH= 7. 5、150mMNaCl和 2%SDSw/v的 溶液将裂解的颗粒回到原始体积。20μL这样的溶液被加载到同样12%丙烯酰胺SDS-PAGE 的泳道3、5、7和9上。因此，泳道1:蛋白质标记物，泳道2和3:分别为ClyA-SS的上清液和 颗粒片段；泳道4和5:分别为ClyA-WT的上清液和颗粒片段；泳道6和7:分别为ClyA-CS 上清液和颗粒片段，泳道8和9:分别为ClyA-AS的上清液和颗粒片段。c)溶血性分析。 ClyA单体（0. 6μM)用100μL的1 %马的红细胞悬浮液孵化（最终体积110μL)，浊度的减 少在650nm(0D650nm)测量。ClyA-WT显示为粗灰线，ClyA-SS以粗黑线显示，ClyA-CS以细 黑线显示，ClyA-AS以虚线显示。d)溶血率（以时间的倒数达到50%的浊度而计算）按蛋 白质浓度绘图，ClyA-WT(三角形，粗灰色线），ClyA-SS(正方形、粗黑线），ClyA-AS(圆形， 虚线）和ClyA-CS(菱形，细黑线）。
[0014] 图7显示了利用4-20%丙烯酰胺BN-PAGE筛分ClyA变体的寡聚反应的实施例。 a)第4轮（Round4)，1泳道和2泳道：ClyA-CS，3泳道和4泳道：4ClyA5, 5泳道和6泳 道：4ClyA3, 7泳道和8泳道：4ClyAl，9泳道和10泳道：4ClyA2,11泳道和12泳道：4ClyA6。 按图6中的说明并补充0· 05% (偶数泳道数）或0· 1% (奇数泳道数）SDS而制备样品。SDS 用来对抗样品中大量DDM的"拖尾"效应。b)第5轮。泳道l、2:5ClyA2,泳道3:5ClyAl，泳 道4:ClyA-AS。样品补充0. 05%SDS。通过添加1%DDM引发寡聚反应，ClyA变体利用方 法中所描述的Ni-NTA亲和色谱法进行部分纯化。
[0015] 图8显示了在-35mV电势下，在150mMNaCl, 15mMTris.HC1中，三种类型ClyA纳 米孔的噪音特征。从〇· 5s轨迹获得I型（短划线），II型（点线）和III型（浅灰色实 线）ClyA-CS纳米孔在-35mV的电流功率谱密度。在OmV的电流功率谱密度如黑线所示。每 条线对应由针对不同的单通道进行的3组记录计算得到的功率谱的平均值。
[0016] 图9显示了HT(a)和FP(b)阻塞在I型ClyA-SS孔上的持续时间。利用设置在 2kHz的内部贝塞尔低通滤波器以10kHz采样率记录轨迹。每个绘制的值对应于利用至少3 个不同的单通道确定的平均值。误差以标准偏差给出。
[0017] 图10显示了 _150mV在I型ClyA上的典型的HT电流阻塞，其显示出"肩值"和"尖 值"的电流特征。在15mMTris.HCl、pH= 7. 5、150mMNaCl中在20nMHT存在下进行记录。 利用具有10, 000Hz截止滤光片的高斯低通滤波器过滤轨迹，并在50, 000Hz进行采样。
[0018] 图11显示了dsDNA(双链DNA)迀移穿过ClyA纳米孔。在电流轨迹的右边，描绘 了ClyA(孔形结构）和中性亲和素（neutravidin)(深灰色），且dsDNA显示为黑线。a)来 自伤寒沙门氏菌的ClyA的区段穿过性（sectionsthrough)，来自伤寒沙门氏菌的ClyA通 过来自大肠杆菌ClyA结构的同源建模而构成（PDB:2WCD，90%序列同一性）。22ClyA以孔 的测量值显示，测量值包括原子的范德瓦尔斯半径，和残基103 (WT序列中的丝氨酸）在所 示孔上的大致位置。b)在 +100mV(水平 1。+1。。= 1. 74±0· 05nA)，0· 12μΜ的 290bpdsDNA 1添加到ClyA纳米孔的顺式侧引起了短暂的电流阻塞IRES= 0. 63±0. 01 (水平1* +1。。= 1. 10±0.03ηΑ，η= 3)，这是由于dsDNA迀移穿过所述孔而致。中性亲和素到顺式腔室的 添加将所述短暂的电流阻塞转变为更高导电性和持久的电流阻塞IRES= 〇. 68±0. 01 (水平 1+1。。= 1. 19±0.01)，这是由于DNA穿过所述孔而发生局部迀移。开孔电流通过将电势反转 到-100mV(红色星号）而恢复。附图显示了典型的瞬时电流阻塞。c)由于在+100mV顺式 准轮烧（pseudorotaxane)的形成而产生的电流阻塞的详情展示。d)在-100mV通过dsDNA: 中性亲和素的复合物（见上文）从反式侧螺旋化而实现的反式准轮烷的形成（水平11DD = 1. 02±0· 03nA,IRES= 0· 62±0· 01，n= 4)。在 22Γ，在pH= 7. 5 的 2· 5MNaCl, 15mMTris. HC1中实施电记录。通过采用10kHz贝塞尔低通滤波器并利用20μs(50kHz)的采样率记录 数据。
[0019] 图12显示了纳米孔-DNA轮烧的形成。a)表示用于形成轮烧的DNA分子的杂 化。箭头指示链的3'端。b)轮烷形成。在-100mV将复合有中性亲和素（0.3μΜ)和寡 核苷酸（〇lig〇)4(lyM)的DNA杂种3(1μΜ)添加到反式腔室之后，ClyA-2的开孔电流 (101。。= -1·71±0·07ηΑ，η = 4)减少到水平1 1M= 1. l±0.04nA(IRES值为0·64±0·02，η =4)，这表明dsDNA从反式侧使所述孔螺旋化。步进达到+100mV(红色星号）生产IRES = 0. 77±0. 04(水平2+1。。= 1.31±0. 09nA，n = 4)的电流阻塞，这表明DNA在正的施加电势 下仍占据该孔。水平2最有可能对应于占据所述孔的前庭的ssDNA。连续切换到正的施 加电势不能恢复开孔电流（图16)，这证实了轮烷的形成是永久性的。c-e)去除轮烷。c) 在+100mV，穿过ClyA-2纳米孔的离子电流显示出大量的快的电流阻塞（图15)，这表明在 所述孔的顺式入口处连接的ssDNA分子瞬时地占据了所述孔的内腔。d)轮烷形成后（图 12b)，在+100mV纳米孔显示稳定的离子电流（水平2+1。。)，这表明单个DNA分子正占据该 孔。e) 20mMDTT添加到顺式腔室后20分钟，在ClyA孔上面的DNA分子被移除，开孔电流在 +100mV时恢复（1。+1。。= 1. 78±0. 07,η= 4)。如图11所描述的进行记录。
[0020] 图 13 显示了对ClyA-CS的ssDNA阻塞。在 +100mV，2μΜ生物素化的ssDNA(5a) 在0. 6μΜ中性亲和素存在下添加到ClyA-CS纳米孔的顺式一侧，引起瞬时电流阻 塞（1.24±0.02nA，IRES= 0·69±0·04，η= 3)，这表明ssDNA可以进入所述孔的内腔， 但只是暂时性的。随后添加互补的ssDNA链（5b)将电流阻塞转变成水平1+1。。阻塞 (1. 22±(X13nA，IRES=(λ67±0· 01，η= 3)，这表明dsDNA现在可以迀移穿过所述孔的整个 长度。
[0021] 图14显示了DNA穿过ClyA纳米孔的转运。a)表示链置换反应的示意图，所述链 置换反应促进DNA从所述孔的释放。b)在+50mV且在3(0. 3μM)存在下，ClyA-2显示了 稳定的开孔电流（1。+5。= 〇. 85±0.OlnA,η= 3)，这表明连接到所述孔的ssDNA链没有螺旋 穿过所述孔的内腔并阻止dsDNA型溶液的迀移。c)ssDNA链6(40nM)添加到顺式腔室产生 了持久的IRES= 〇. 70±0. 02(水平 2+5。= 0. 59±0. 02nA，n= 5)的电流阻塞，这表明dsDNA 杂种使所述孔螺旋化。d)随后将也包含0. 3μΜ中性亲和素的1μΜ的7添加到反式腔室 (+50mV)促进了DNA螺旋的释放并恢复了开孔电流。随后，如多个阻塞电流和开孔电流所 示，dsDNA分子顺序地被捕获并释放。为了清楚起见，附图中未包括中性亲和素。在22°C、 pH= 7. 5的2. 5MNaCl和15mMTris.HC1中进行电记录。通过采用10kHz贝塞尔低通滤波 器并利用20μs(50kHz)的采样率记录数据。对图d中的电流信号在2kHz使用后捕获低通 高斯滤波器进行数字滤波。由于在更高的施加电势下，处于顺式的DNA的捕获非常快，因此 该实验的施加电势设置在+50mV以促进对多个阻塞和释放的观察（图14d)。
[0022] 图15显示了对比实验的结果，其显示出图12的所有组分都是形成DNA轮烷所必 需的。a)桥接序列4的缺失会使得ClyA-2和3之间无法进行连接。在-100mV复合物被 捕获之后，在+100mV(星号）所述复合物容易地被从孔中驱逐出，正如在+100mV时ClyA-2 的开孔电流的典型电流特征所示。b)当在-100mV被捕获时，2从孔顶部的缺失（例如 用DTT分裂后）无法使所述3 · 4DNA杂化以结合到所述孔。在电势反转到+100mV(红色 星号）时，开孔电流恢复。c)在+100mV对于ClyA-2纳米孔的典型的电流记录。d)20秒 的a中所示电流轨迹的全点直方图（5pA面元（bin)尺寸）。水平1。+1。。= 1. 71±0. 07nA, 水平A= 1. 62±0. 12nA,水平B= 1. 43±0. 05nA和水平C= 1. 28±0. 06nA，分别对应 0. 94±0. 04, 0. 84±0. 03和0. 75±0. 03的IRES值。从12个实验计算出的各值可以代表寄 宿在ClyA的内腔中的DNA链。
[0023] 图16显示了ClyA-2纳米孔的电流和电压（IV)关系，a)轮烷形成之前（最浅的灰 线）和之后（黑线）的ClyA-2的典型曲线。中度灰色线表示在DNA分子连接到纳米孔之后 的该同一纳米孔通过添加DDT被移除。通过施加在4秒内将电压从-100mV转变到+100mV 的自动化协议来测量电流记录。b)从4个实验的平均值计算电流-电压曲线，该曲线显示 出稳态（Is)的ClyA-2开孔电流水平（白球）和轮烷构型中的ClyA-2开孔电流水平（黑 球）。对于在正偏压和负偏压下的ClyA-2,从电流-电压曲线的斜率计算的纳米孔的单一 电导值是17.InS，对于负