尖值则另外表明，ClyA纳米孔可能需要变形以允许折叠的HT穿过I型纳 米孔进行迀移。
[0084] 实施例6.dsDNA穿过ClyA孔的迀移
[0085] 在这部分工作中，当与野生型ClyA相比时，选择ClyA-CS，因为其在平面脂质双分 子层中具有增强的活性、溶解度和有利行为。ClyA十二聚体的内直径（在其狭窄入口处是 3. 8nm，17图11a)大于dsDNA(B型是2. 2nm)的直径，这表明dsDNA应容易电泳迀移穿过所述 孔。然而，最有可能的是由于排列在ClyA内腔中的带负电荷的残基（pi= 5. 1)，因此在生理 盐浓度下，ssDNA不能进入所述纳米孔。7a基于之前对在高碱性pH值下的α溶血素（aHL) 纳米孔的研究工作，7~在高离子强度下测试了DNA迀移穿过ClyA-CS纳米孔的能力，其中 对所述孔的内部电荷进行了筛选。在2. 5MNaCl，15mMTris.HCl，pH7. 5中，且在+100mV施 加电势下，由于DNA进入所述孔的内腔的入口，向顺式腔室添加0. 12μΜ生物素化的dsDNA l(290bp，表2)产生达到开孔电流（I。）的瞬时电流阻塞（IB)时，显示出0. 63±0. 01的残余 电流（IRES=IB/I。）（水平 1*+1。。= 1. 1〇±〇· 03ηΑ，η= 3 次实验）和 2. 0±0· 6 的停留时间 (图lib)。随后向顺式腔室添加0. 3μΜ的中性亲和素（其与生物素形成紧密复合物），将 瞬时阻塞转换成持久的具有更高残余电流值（IRES= 0. 68±0. 01)的电流阻塞（水平1 +1。。 =1. 19±0.OlnA,η= 4)。开孔电流可以通过反转施加的电势至-100mV而恢复（图lib)。 这些结果表明，通过形成顺式蛋白：DNA复合物，中性亲和素能阻止DNA完全迀移穿过ClyA 纳米孔，所述DNA复合物中，DNA占据了所述孔的全长（图11c)。当dsDNA:中性亲和素复 合物螺旋穿过反式侧时，在-l〇〇mV也可以形成反式复合物（水平1 1QQ= 1. 02±0· 03nA，IRES =0· 62±0· 01，n= 4)(图lid)。
[0086] 实施例7.轮烷系统捕获ClyA纳米孔内的dsDNA
[0087] 轮烷是超分子联锁系统，其中，线性单元（螺旋状）迀移穿过短周期环并通过两个 大的取代基（阻剂（stopper))封端。这种机械连接的分子具有如用作分子电子学的开关 或分子机械装置的组分等应用。轮烷是由包括dsDNA22在内的多种分子而形成，或通过锁定 生物素化的ssDNA分子螺旋穿过aHL纳米孔而形成，所述aHL纳米孔的一侧上有抗生蛋 白链菌素，另一侧上有DNA发夹（dsDN不能迀移穿过aHL)。23在此为了证明dsDNA穿过 ClyA纳米孔的迀移，建立轮烷系统，其中，添加到ClyA纳米孔反式侧的dsDNA分子，在螺旋 穿过纳米孔的内腔后，与顺式侧的第二DNA链杂化。使用ClyA纳米孔ClyA-2,所述ClyA-2 包含12个ssDNA分子2 (51个碱基，表2,图12a)，所述ssDNA分子2在它们的5'端通过二 硫键共价连接至在所述孔的顺式入口引入的Cys残基（在位置103,图11a)。2被设计成作 为轮烷阻剂。螺旋3是dsDNA分子（59bp，表2)，其在5'端具有额外的31个核碱基长度， 该长度被设计成用于通过与寡核苷酸6的杂化作用而在顺式侧与阻剂杂化；3'生物素化接 头，其用于与中性亲和素在反式侧络合。所述螺旋和阻剂在顺式侧的连接是通过ssDNA桥 接分子4介导的（表2,图12a)，所述ssDNA桥接分子4与2的最前面的16个核碱基以及3 的最后25个核碱基互补。当添加3和4至反式腔室时，在-lOOmV，DNA螺旋被所述孔捕获 并且在电势反转至+100mV(水平2+1。。，IRES= 0· 77±0· 04,η= 4)时不会从所述孔中释放， 这表明形成了DNA轮烷（图12b)。感兴趣的是，在+100mV，所述轮烷的残余电流高于顺式 或反式准轮烷螺旋的IRES值（分别为〇. 68±0. 01，0. 62±0. 01)，这表明在此电势下，2的未 杂化ssDNA长度可能跨越所述孔（图12b)。所述轮烷可以通过添加20mMDDT至顺式腔室 而分解，这会还原2和ClyA之间的二硫键和并恢复在+100mV下的开孔电流（图12c-12e)。
[0088] 选择性迀移穿过ClyA-2孔
[0089] 数据表明，ClyA-2从所述孔的孔腔排除非特异性DNA，这表明连接在孔上的网格 状ssDNA分子可能对非螺旋状DNA迀移产生了空间或静电阻碍。此外，连接至孔的DNA常常 占据孔内腔（图15c)，从而阻止其他DNA分子进入。当特定的DNA分子与ClyA-2杂化时，在 正的施加电势下可以观察到快速的DNA捕获。连接至孔的ssDNA的浓度预先估计约20mM。 21因此，在接近孔开口处的dsDNA浓度的提高可以增强对特定DNA链的捕获。在这种情况 下，未杂化的链2可以仍然连接至所述孔，在这种情况下，dsDNA结构可能必须与SSDNA2竞 争进入孔内腔。
[0090] 实施例8.利用链置换反应的纳米孔：DNA设备
[0091] 在高的正施加电势下，ClyA-2纳米孔的离子电流在开孔水平和若干闭孔水平之间 波动（图12c，图15和16a)，这表明连接至孔顶部的ssDNA分子进入ClyA的内腔但不是永 久地螺旋连接至所述孔的反式侧。&进一步表明了该解释；在+100mV，与中性亲和素复合的 90聚体ssDNA5a(表2)添加至ClyA-CS顺式侧引发瞬变电流阻塞（图13)，这在随后添加 等摩尔浓度的互补ssDNA5b时转变为持久的DNA迀移事件（表2,图13)。DNA穿过纳米孔 的迀移经常在高于阀电势时观察到24 27,所述阀电势可以通过调整孔内腔的电荷分布来调 节，26'27或通过改变溶液的离子强度来调节。&' 28因此，最有可能是因为所述孔具有较低电 荷密度和/或较高的灵活性，这些发现表明对于DNA的迀移，ssDNA具有比dsDNA更高的阈 值（图13)。
[0092] 这些结果表明，尽管施加的电势，连接到ClyA顺式入口的ssDNA分子可能取样顺 式溶液。另一方面如果DNA分子在正的施加电势下变为双链（例如通过链杂交），则dsDNA 链将迀移穿过所述孔和取样反式溶液。因此，纳米孔：DNA设备设计成，在其中特定的DNA链 到纳米孔顺式侧的杂化促进DNA杂种穿过所述孔的迀移。之后DNA:纳米孔复合物通过链 置换反应而分解（图14a)，这将促进DNA穿过双分子层的转运和促进2的返回以采样顺式 腔室。方便地，在正的施加电势下，dsDNA分子添加到ClyA-2顺式侧不产生电流阻塞（图 18)，这表明连接到ClyA-2的ssDNA分子阻止或大大减少了DNA从溶液的迀移。因此，纳米 孔顶部的DNA单元可以通过促进特异性DNA分子的迀移同时建立对非特异性DNA迀移的屏 障而推断出系统的特异性。在+50mv，将3添加至ClyA-2顺式侧没有产生电流阻塞，这进一 步证实，连接至ClyA-2的ssDNA分子阻止了溶液中的DNA进入孔（图14b)。尽管如此，在添 加至6的顺式腔室后一一所述6与2的最前面15个碱基以及3的最后12个碱基互补（表 2)，dsDNA杂种纳米孔显示出永久电流阻塞，IRES= 0. 70±0. 02(水平2 +5。= 0. 59±0. 02nA， 图14c，η= 5)，这是DNA捕获的标志。3到反式侧的迀移通过在将中性亲和素添加至反式 腔室时轮烷的形成而证实（图14c-d，图17e-f)。至关重要的是，6被设计成包括10个核碱 基的5'单链延伸来作为轮烷分解的支点（图14a)。值得注意的是，添加至7-一与6互补 的ssDNA分子一一的反式腔室（表2)，能将3通过到所述支点的首次杂化从纳米孔中释放 出，然后促进链置换（图14a)。这是通过开孔电流的恢复观察到的，因为在3和6从所述孔 中释放后，ssDNA分子连接到返回顺式侧的ClyA上（图14d)。值得注意的是，当DNA货物 (cargo)被从顺式腔室捕获、转运穿过纳米孔和释放到反式腔室时，该纳米孔显示出一系列 的打开和阻塞的电流水平，这反映出捕获、迀移和释放这一周期（图14d)。
[0093] 在+50mV和+100mV下，在ClyA-2纳米孔顶部的DNA链大幅减少了对非特异性DNA 的捕获（图18)，这表明在所述孔顶部的DNA阻止来自溶液的dsDNA的迀移。值得注意的 是，施加的电势设置为+50mV而不是+100mV，因为在+100mV，ClyA-2偶尔会产生长的电流 阻塞，其类似于由对非特异性DNA的捕获引起的典型事件（图18)。在较低施加电势下，这 种电流阻塞不太频繁；因此实验是在+50mV(图14)和+35mV(图20)实施。在较低施加电 势下起作用的另一原因，如图14的说明中所解释的，是DNA捕获的频率随着电势而减少，因 此在较低电势下，捕获和释放的周期更容易观察到。
[0094] ssDNA和dsDNA的迁移
[0095] 在轮烷构造中，在正的施加电势下，ssDNA分子可以跨越孔的整个长度。这很可能 是因为在+l〇〇mv轮烷的IRES值（0. 77)高于顺式和反式准轮烷的IRES值（分别为0. 68和 0.62,图11c和lid)，所述准轮烷具有固定在所述孔内的dsDNA。此外，由电流-电压曲线 的斜率计算的轮烷单一电导值在正施加电势下（10. 8nS)比在正偏电压下（13.OnS，图16) 低。由于ssDNA的直径（d=lnm)小于dsDNA(对于B型，d= 2. 2)，这些结果进一步表明 在正偏电压下ssDNA占据所述孔。为进一步研究ssDNA跨越所述孔的能力，测试了DNA杂种 3迀移穿过ClyA-CS孔的能力，所述DNA杂种3是通过59个核碱基对的3'生物素化dsDNA 段后跟5'端的31个核碱基的ssDNA长度而形成的。在+100mV，将与中性亲和素复合的3 添加到ClyA-CS孔的顺式侧引起了持久的电流阻塞，IRES= 0. 67 (图19)，顺式准轮烷有相同 的IRES值（〇. 68)，这表明在此电势下，DNA杂种迀移穿过ClyA并且dsDNA跨约所述孔的内 腔。由于3的迀移只能从ssDNA末端开始，这些结果表明，在+100mV，ssDNA的主要序列能 够迀移穿过ClyA的内腔。感兴趣的是，在+50mV和+70mV，电流阻塞只是瞬时的（图19)， 这表明在这个电压下，ssDNA不能穿过ClyA孔。在+70mV，链6--其与3的最后12个核 碱基互补一一的添加产生持久的电流阻塞（图19)，这表明DNA迀移的阈值降低。
[0096]材料与方法
[0097] 筛选ClyA纳米孔
[0098] 通过使用pT7质粒使ClyA在大肠杆菌属（E.cloni) 表达体BL21 (DE3)细 胞（Lucigen)中表达。转化体在具有5 %马血的布鲁氏琼脂（BrucellaAgar) (BBL?， Becton,DickinsonandCompany)上预筛选，并在96深孔板上单独生长和过量表达。针对 马红细胞（bioM6rieux)的溶血活性，对来自细胞裂解物的单体进行第一次筛选，然后通过 使用Ni-NTA亲和色谱法进行纯化。纯化后的单体在0. 5%β-十二烷基麦芽糖苷（GLYC0N BiochemicalsGmbH)12存在下进行寡聚，并将其加载到为天然凝胶的电泳凝胶上以检查其 寡聚反应。ClyA寡聚体的电性能在平面脂质双分子层中进行筛选。
[0099] 进化的ClyA纳米孔的纯化
[0100] 通过使用pT7质粒使ClyA在大肠杆菌属:?表达体BL21(DE3)细胞中表达。通 过使用Ni-NTA亲和色谱法纯化单体，使单体在0. 2%β-十二烷基麦芽糖苷（GLYC0N BiochemicalsGmbH)存在下进行寡聚。
[0101] 电记录
[0102] 离子电流通过来自由二植烧酰基-sn_丙三氧基-3-磷酸胆碱（diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)(AvantiPolarLipids,Alabaster，AL)形成的平面双分子层 的记录进行测量。通过膜片钳放大器（Axopatch200B,AxonInstruments,福斯特城，CA) 用Ag/AgCl电极测量电流。18
[0103] 利用易错PCR构建ClyA库
[0104] 使用T7启动子和T7终止子引物通过扩增来自质粒DNA的ClyA基因构建库（表 3)。我们的第一轮诱变中，我们使用包含对来自伤寒沙门氏菌的ClyA-SS进行编码的合 成基因的质粒作为模板。从第二轮诱变起，我们使用从前一轮选择得到的DNA质粒。在 ClyA-SS中，通过将两个Cys残基（位置87和285)用Ser取代和通过连接编码Gly-Ser-Ser 接头的DNA然后连接C-末端六聚组氨酸标签来修饰WT序列。7a
[0105]DNA扩增是通过易错PCR实现的：将400μL的PCR混合物（200μ1REDTaq预混 液（ReadyMix)，8μΜ正向和反向引物的最终浓度，约400ng的质粒模板和达到400μ1的 ddH20)分为8个包含0-0. 2mMMnCl2的反应混合物，并循环27次（在95°C预孵化3分钟， 然后循环：在95°C变性15秒，在55°C退火15秒，在72°C延续3分钟）。在最终的库中每个 基因在这些条件下通常产生1 - 4个突变。PCR产品汇集在一起，进行凝胶纯化（QIA快速凝 胶萃取试剂盒（QIAquickGelExtractionKit)，Qiagen)并通过MEGAWH0P过程克隆进pT7 表达质粒（PT7-SC1)，所述MEGAWH0P过程为19:约500ng纯化PCR产品与约300ngClyA-SS 环状DNA模板混合，在50yL最终体积中利用PhireHotStartIIDNA聚合酶（Finnzymes) 实施扩增（在98°C预孵化30秒，然后循环：在98°C变性5秒，在72°C延续1. 5分钟，循环 30次）。在37°C通过用DpnI(1FDU)孵化2小时消除圆形模板。得到的混合物通过琼脂 糖凝胶（在Milli-Q水中2. 5%琼脂糖）透析而脱盐并通过电穿孔转变为大肠杆菌属? 10G 细胞（Lucigen)。转变后的细菌在氨苄青霉素（100yg/ml)LB琼脂板上在37°C生长过夜 (100μg/mL)通常产生>105的菌落，收集转变后的细菌以用于库质粒DNA的制备。
[0106] 在进化的ClyA的位置87构建饱和诱变库
[0107] 为了拥有包含无半胱氨酸的ClyA变体的库，使用87NNS引物（包含在87位置编 码全套氨基酸的简并密码子，表3)和T7终止子引物扩增4ClyA4的基因编码（表2)。PCR条件：0. 3mL最终体积的PCR混合物（ReadyMix?)，所述PCR混合物包含约400ng的模板质 粒，循环30次（在95°C预孵化3分钟，然后循环：在95°C变性15秒，在55°C退火15秒，在 72°C延续3分钟）。使用4ClyA4圆形模板通过MEGAWH0P过程（见上文）将得到的PCR产 品克隆到PT7表达质粒中。
[0108]ClyA-WT的构建
[0109]ClyA-SS基因使用87C和285C引物扩增（表3)。PCR条件：0· 3mL最终体积的PCR 混合物（150μ1的REDTaq1^&(^1^1，6以1正向和反向引物，约40〇1^模板质粒），循环27 次（在95°C预孵化3分钟，然后循环：在95°C变性15秒，在55°C退火15秒，在72°C延续 3分钟）。使用ClyA-SS圆形模板通过上文描述的MEGAWHOP过程将得到的PCR产品克隆到 PT7表达质粒中。
[0110] 筛选ClyA库和溶血试验
[0111] 由于ClyA-SS显示"检测边界"的溶血活性，因此在诱变的前两轮中，在具有5% 马血的布鲁氏琼脂上，库只对于活性进行筛选。从第三轮选择开始，对在布鲁氏琼脂上显示 溶血活性的菌落进一步进行针对马红细胞溶血活性的筛选，所述马红细胞来自过量表达后 的粗制裂解物。这项工作的目的是获得ClyA变体，所述ClyA变体在β-十二烷基麦芽糖 苷（DDM)中很好地寡聚，并在脂质双分子层中形成具有较低电噪音和均匀的单一电导的纳 米孔。因此，单独针对溶血活性的筛选不能作为这类变体的选择的唯一标准（例如WT-ClyA 溶血性非常活跃，但是显示不均匀的单一电流分布）。因此，从第四轮开始，利用Ni-NTA亲 和色谱法纯化来自粗制裂解物的蛋白质，在DDM中孵化后，在BN-PAGE中测试ClyA的寡聚。 很好地寡聚的ClyA纳米孔之后在平面脂质双分子层中进行测试（特别强调的是在高施加 电势下，所形成的通道的一致性、低电噪音和稳定性）。
[0112] 在布鲁氏菌马血琼脂板上筛选溶血活性
[0113] 在质粒DNA经电穿孔进入大肠杆菌属錢表达体BL21 (DE3)细胞（Lucigen) 之后，转化体在具有5 %马血并补充有100μg/ml氨苄青霉素的布鲁氏琼脂（BBL?， Becton,DickinsonandCompany)上进行预筛选，在37°C生长过夜之后通过在菌落周围的 裂解光环（lyticaura)观察显示溶血活性的克隆体，所述显示溶血活性的克隆体在37°C 通过摇晃在96深孔板上单独生长（包含100μg/mL氨苄青霉素的0. 5mL的2xYT介质）。 汇聚获得的培养物用于制备质粒DNA(QIAprep，Qiagen)以用作下一轮（第1和2轮）的模 板，或用作对于蛋白质过量表达的起子（第3-5轮）。
[0114] 对ClyA过量表达之后粗制裂解物的溶血活性的筛选
[0115] 第3-5轮：50μ1来自400-600个克隆体的起子培养物（见上文）接种到在新的 96深孔板中的450μ1新鲜介质中，所述培养物在37°C生长直到0D_约为0.8。然后添加 IPTG(0. 5mM)以诱导过量表达，温度降低到25°C用于过夜孵化。第二天，在4°C通过在3000x g离心15分钟获得细菌，舍弃上清液，在-70°C孵化颗粒（pellet)几小时来促进细胞破 坏。然后颗粒重悬浮在〇. 3mL的裂解缓冲液中（15mMTris.HC1pH7. 5，150mMNaCl，lmM MgCl2, 10μg/ml溶解酵素和0. 2单位/mLDNA酶I)，并在37°C通过在1300RPM摇晃30分 钟裂解。之后将5-30μL裂解液添加到100uL约1 %的马红细胞悬浮液中。所述马红细胞 悬浮液是通过在4°C在6000xg离心马血（bioM6rieux) 5分钟来制备，所述颗粒重悬浮在 pH= 7. 5的15mMTris.HC1，150mMNaCl中（如果上清液显示为红色，将溶液再次离心并将 颗粒重悬浮在同样的缓冲液中）。通过在650nm0D随着时间的减少来监控溶血活性（约 3-10分钟的间隔，使用MultiskanG0微孔板分光光度计测试，ThermoScientific)。将克 隆体的溶血活性与来自前一轮的在同一板块上生长的作为参考的2 - 4个亲本克隆体的活 性进行比较。
[0116] 对进化的变体的寡聚和其纳米孔的形成进行筛选
[0117] 第4轮：来自相同裂解液的6 - 12个最具溶血活性的变体进行部分纯化，所述裂 解液用于通过Ni-NTA亲和色谱法进行溶血活性的筛选，所述Ni-NTA亲和色谱法：将包含单 体型ClyA的 0· 2mL粗制裂解液用 15mMTris.HC1,pH7· 5, 150mMNaCl并补充 1%DDM(以 触发ClyA寡聚反应）和lOmM咪唑而变成lmL，在环境温度孵化20分钟并在4°C在20'000x g离心10分钟。将澄清的裂解液与20μL(珠体积）Ni-NTA琼脂糖珠（Qiagen)通过在4°C 温和混合结合1小时。通过在4°C在20'OOOxg离心10分钟除去未结合的片段（上清液 被丢弃）。最后，利用 50yL600mM咪唑在 15mMTris.HClpH7.5150mMNaCl0.2%DDM 中洗提寡聚的ClyA蛋白质。一般，对40yg的ClyA用约10%甘油和lx的NativePAGE? 电泳缓冲液和lx阴极缓冲添加剂（Irwitrogen?)进行补充，之后装到BN-PAGE上（图7)。 在BN-PAG上形成寡聚体的变体在平面脂质双分子层中进行测试（特别