代，删 除和/或添加。例如，可以设计孔内腔中的修饰以改变孔的大小，结合性质和/或结构。在 一些实施方式中，Cys残基被其他氨基酸如丝氨酸残基取代。修饰的孔蛋白可以是包含多个 亚基的孔，例如，7至11个亚基，12个亚基，13个亚基，或者14个亚基，其中至少一个亚基包 含修饰的氨基酸。在某些实施方式中，修饰的ClyA来自革兰氏阴性细菌如沙门氏菌或大肠 杆菌（E.coli)。在一些实施方式中，修饰的溶细胞素是来自伤寒沙门氏菌（S.typhi)或副 伤寒沙门氏菌（S.paratyphi)的修饰的ClyA。在一些实施方式中，修饰的ClyA孔包括12 个亚基，每个亚基包含SEQIDNo: 1中所示的序列。
[0056] 在某些实施方式中，穿过修饰的ClyA孔施加不同的电势。例如，穿过修饰的ClyA 孔施加的电势的范围可以从_90mV到+90mV。电势可以是-90mV，-85mV，-80mV，-75mV，-70mV ，-65mV，-60mV，-55mV，-50mV，-45mV，-40mV，-35mV，-30mV，-25mV，-20mV，-15mV，-10mV，-5mV， OmV，+5mV，+10mV，+15mV，+20mV，+25mV，+30mV，+35mV，40+mV，+45mV，+50mV，+55mV，+60mV， +65mV，+70mV，+80mV，+85mV，和/或+90mV。在每个电压下，可以测量电流并与一个或多个 参考电流比较。在一些实施方式中，参考电流在打开的、未阻塞的孔中测量。在一些实施方 式中，参考电流在结合至已知蛋白的修饰的ClyA孔中测量，所述已知蛋白例如，其存在与 否可在溶液中确定的蛋白。
[0057] 在某些实施方式中，与打开的、为阻塞的孔相比，蛋白质分析物与修饰的ClyA孔 之间的相互作用引起了电流阻塞。电流阻塞的幅值可以作为开孔电流的残余电流百分比 (IRES)而被测量。在一些实施方式中，特征性的电流阻塞用于识别特定的蛋白质分析物。例 如，电流阻塞可以是短的，快速的电流尖值。电流阻塞可以是瞬时的，或者可以持续超过1 分钟。电流阻塞可以是浅的或可以是深的。浅的电流水平可以由约41-100%的IRES值表示， 表明目标蛋白质分析物留下了约为开孔电流的41 %，45%，50 %，55 %，60 %，65 %，70 %， 75%，80%，85%，90%，95%或100%的残余电流。相反，深的电流水平可以由约0-40%的 IRES值表示，表明目标分析物留下了约为开孔电流的〇%，5%，10%，15%，20%，25%，30%， 35%或40%的残余电流。在一些实施方式中，电流阻塞包含多于一个的电流水平，例如，电 流阻塞可以包含浅的电流水平和深的电流水平。在一个例示的修饰的ClyA孔中，目标分析 物可以引发IRES值约为70%的第一电流阻塞和IRES值约为15%的第二电流阻塞。在某些实 施方式中，通过来自蛋白质分析物的浅的和深的电流水平与来自参考配体的浅的和深的电 流水平的比较来确定蛋白质分析物的存在和/或其同一性。可以比较浅的和深的电流水平 之间的相互转换，例如，可以比较IRES值，可以比较浅的和深的电流水平之间的转换率，可以 比较浅的和深的电流水平的相对持续时间，和/或可以比较浅的和深的电流水平的数量。
[0058] 对任何目标蛋白质分析物，当穿过修饰的ClyA孔的电压变化时，浅的和/或深的 电流水平的百分比也可以变化。浅的和/或深的电流水平的分布可以依据目标蛋白质分析 物而不同。因此，在一些实施方式中，两个或多个目标分析物根据它们的电流水平测量值而 彼此相区别。两个或多个目标蛋白质分析物可以通过它们的电流阻塞的强度和持续时间和 /或通过它们的电流水平分布来区别。例如，当增强穿过孔的电压时，第一蛋白可以显示出 浅电流水平百分比的大幅度减少，而第二蛋白可以显示更多的逐步减少。
[0059] 在某些实施方式中，两个或多个目标蛋白质约95%，90%，85%，80%，75%或 70 %相同。在某些实施方式中，两个或多个目标蛋白质或它们的亚基约65 %，60 %，55 %， 50%或45%相同。在一些实施方式中，两个或多个目标蛋白质是相同的蛋白质的物种特异 形式。
[0060] 2.核酸的迀移
[0061] 本发明的一个方面是能够结合、检测、识别、迀移核酸和/或调整核酸的转运的修 饰的ClyA孔。迀移穿过修饰的ClyA孔的核酸包括但不限于可以或不可以携带转译后修饰 (如甲基化）的DNA;RNA诸如转移RNA(tRNA)，信使RNA(mRNA)，核糖体RNA(rRNA)，小干扰 RNA(siRNA)，微小RNA(miRNA)，小核仁RNA(snoRNA)、小核RNA(snRNA)，细胞外RNA(exRNA)， Piwi相互作用RNA(piRNA)，以及任何非编码RNA(ncRNA)。核酸类似物如2' -0-甲基取代 RNA，锁核酸（LNA)，吗啉代，和肽核酸（PNA)，双脱氧核苷酸等。
[0062] 在某些实施方式中，修饰的ClyA孔被设计为用于迀移DNA例如ssDNA或dsDNA。虽 然由于来自内腔中带负电荷残基的排斥电荷，特别是ssDNA在生理盐条件下可能不能进入 修饰的ClyA孔，但是在高离子强度条件下，DNA迀移穿过本文所述的修饰的ClyA孔。在一 些实施方式中，高离子强度条件是2. 5MNaCl溶液（或等效于2. 5MNaCl溶液的离子强度）。 在某些实施方式中，高离子强度条件是高于2. 5M氯化钠的离子强度，例如，高离子强度条 件可以是 75M，3M，3· 25M，3· 5M，3· 75M，4M，4. 25M，4. 5M，4. 75M，或 5MNaCl溶液（或可以等 效于上述NaCl溶液的离子强度）和/或可以是（或可以等效于）2·75Μ，3Μ，3·25Μ，3·5Μ， 3. 75Μ，4Μ，4. 25Μ，4. 5Μ，4. 75Μ或5ΜKC1溶液。排布在ClyA孔的内腔中的带负电荷的残基 可以在这些条件下进行筛选。例如，在+100mV，在pH值为7. 5的2. 5MNaCl，15mMTris-HCl 中，将dsDNA添加到本文所述的修饰的ClyA孔时，由于dsDNA迀移穿过所述孔，可以产生短 暂的电流阻塞。如本文所示，在这些条件下dsDNA迀移穿过修饰的ClyA孔。此外，ssDNA可 以迀移穿过修饰的ClyA孔，例如在高离子强度条件下和/或在折叠结构中。ssDNA可以以 与dsDNA不同的速度迀移穿过修饰的ClyA孔。
[0063] 因此，本发明的一个方面是用于迀移DNA的方法，例如dsDNA穿过能够迀移DNA的 修饰的ClyA孔，所述方法包括以下步骤：获得本文所述的修饰的ClyA孔，施加至少+50mV 的电压穿过所述修饰的ClyA孔，将包含DNA的样品添加至所述修饰的ClyA孔的顺式开口， 测量流经所述孔的电流。电流阻塞表明DNA发生迀移。通过将电势反转为负电势如-100mV 或-50mV可以恢复电流。在一些实施方式中，修饰的ClyA孔在高离子强度条件下使用。
[0064] 在一些实施方式中，用于迀移DNA的修饰的ClyA孔包含本文所述的修饰的ClyA 孔。所述修饰的ClyA孔可以设计成用于迀移核酸。例如，所述修饰的ClyA孔可以包含至 少12个亚基，其中每个亚基包含由与SEQIDNO: 1至少80%相同的氨基酸序列表示的多 肽，其中精确地只有一个Cys残基被Ser取代。每个亚基可以由与SEQIDN0:1至少85%， 90%，95%，96%，96%，98%或99%相同的氨基酸序列表示，另外，精确地只有一个Cys残 基可以被Ser取代。所述Cys残基可以是SEQIDΝΟ:1中的Cys87和/或Cys285。在一 些实施方式中，Cys残基是Cys285。其他的氨基酸残基可以被例如与其具有相似性质如结 构、电荷、疏水性或亲水性的氨基酸取代。在某些实施方式中，被取代的残基是L99,E103， F166，K294中的一个或多个。例如，被取代的残基可以是L99Q，E103G，F166Y和K294R中的 一个或多个。因此，每个亚基可以包含由SEQIDNO:2的氨基酸序列表示的多肽。一个例 示的包含下述亚基的修饰的ClyA孔可以被称为ClyA-CS:其中精确地只有一个Cys残基被 Ser取代。
[0065] 在一些实施方式中，在固定的跨膜电势下，修饰的ClyA孔识别并伴随特定的DNA 分子穿过生物膜。反应机理可以是基于DNA链的置换。例如，一部分DNA可以与纳米孔共 辄，以便通过DNA链的置换反应，转运选择的DNA分子穿过所述纳米孔。在某些实施方式 中，所述修饰的ClyA孔包括至少12个亚基，其中每个亚基包含C87S，C285S和D103C取代 基，并且每个亚基与寡核苷酸共辄。因此，在一些实施方式中，用于迀移dsDNA的方法包含： (a)获得包含至少12个亚基的修饰的ClyA孔，其中每个亚基包含C87S，C285S和D103C取 代基并与寡核苷酸共辄；(b)施加+50mV的电压穿过本文所述的修饰的ClyA孔，（c)将包 含dsDNA的样品添加至所述修饰的ClyA孔的顺式开口，⑷将第一单链核酸添加至所述修 饰的ClyA孔的顺式开口，所述第一单链核酸包含（i)与和所述ClyA孔共辄的寡核苷酸的 至少15个核碱基互补的序列，和（ii)与双链DNA的至少12个核碱基互补的序列；测量穿 过修饰的ClyA孔的电流，其中步骤（d)之后的电流降低表明双链DNA穿过所述修饰的ClyA 孔发生迀移。
[0066] 在一些实施方式中，所述方法可选地包括将第二单链核酸添加至修饰的ClyA纳 米孔的反式开口，所述第二单链核酸包含与第一单链核酸互补的序列。在这里，在第二单链 核酸添加至修饰的ClyA纳米孔的反式开口之后，穿过修饰的ClyA孔的电流增加，表明双链 DNA已经完全迀移穿过所述孔。
[0067] 本发明的另一方面涉及用于迀移DNA的装置，包括：充满流体的腔室，其由膜分隔 成第一腔室和第二腔室；能够施加穿过所述膜的电势的电极；插入所述膜中的一个或多个 纳米孔；在所述膜的1个腔室中的高离子强度溶液，其中DNA从第一腔室迀移穿过所述纳米 孔到第二腔室。在某些实施方式中，DNA是双链DNA。纳米孔可以是ClyA孔，例如，本文所 述的修饰的ClyA孔。所述孔，如修饰的ClyA孔，可以具有至少2. 2nm的内径。在一些实施 方式中，所述膜是人工脂质双分子层。在一些实施方式中，穿过膜的电势的范围从-l〇〇mV 到+100mV。高离子强度溶液可以包含2. 5MNaCl。
[0068] 实施例
[0069] 上文已提出了总的发明，下面的实施例帮助说明该总的发明。所包括的这些具体 的实施例仅仅是为了说明本发明的某些方面和实施方式，它们并不意在限制任何方面。然 而，在实施例中描述的某些一般原则，通常可以适用于本发明的其他方面或实施方式。
[0070] 实施例1.通过定向进化调谐ClyA的性质
[0071] 使用用于剪切具有所需性质的酶的定向进化方法来改善ClyA-SS的活性，原因是 能补偿C87S和C285S取代基的有害影响的突变也会增加所述纳米孔在脂质双分子层中的 稳定性。通过易错PCR(每轮每个基因约1-4个突变）在ClyA-SS的背景下产生随机库并且 针对溶血活性筛选所述随机库（图6)。然后通过Ni-NTA亲和色谱法纯化最活跃的变体并 用该变体通过BN-PAGE检测寡聚体的形成（图7)。针对所需的性能（低电噪音和在高施加 电势下保持打开的能力），挑选的纳米孔变体最终在平面脂质双分子层中进行筛选，所述所 需的性能作为选择的最终和关键标准。短短4轮筛选后，ClyA-CS变体被分离出来（表1)， 其显示出低电噪音（图8)，并在+90到-150的电势下在平面脂质双分子层中保持打开。值 得注意的是，在位置87的丝氨酸转换回半胱氨酸，所述半胱氨酸是野生型基因中的原始残 基。为了获得适于进行位点特异性化学修饰的半胱氨酸更少的ClyA变体，ClyA-CS在位置 87进行饱和诱变，筛选生成的库，并选择具有所需电性能（SI)的半胱氨酸更少的ClyA-AS。 与ClyA-SS相比，在可溶片段的大肠杆菌细胞中（图6)和单体中表达的进化的ClyA纳米 孔可以通过亲和色谱法进行一步纯化，这使产量了增加十倍（每l〇ml培养液约0. 6mg)。 [0072]实施例2.分离具有不同尺寸的ClyA纳米孔
[0073]ClyA寡聚体，由具有0.5 %w/vβ-十二烷基麦芽糖苷（DDM)的ClyA单体孵化而 成，在BN-PAGE上显示多个带（图2a)，这表明ClyA可能装配成了几个寡聚体状态。这是特 别吸引人的，因为大肠杆菌ClyA寡聚化的确切化学计量是有争议的。ClyA晶体结构（PDB_ ID:2WCD)显示了一个在顺式侧具有5.5nm的开口且在反式入口具有3.3nm的开口（包括氨 基酸侧链的范德瓦尔斯半径）的十二聚体，而早期的冷冻电镜结构显示的是具有8 11或1312 个亚基的纳米孔。
[0074] 在平面脂质双分子层中，用DDM预孵化的ClyA-WT显示出开口纳米孔电导跨度大 约2nS的宽分布（图2b，顶部），这表明在脂质双分子层中ClyA-WT也可以组装成不同大 小和/或几何形状的纳米孔。ClyA-WT单一电导（I型ClyA)分布的主峰仅代表了 24%的 重组纳米孔并在1.7到1.9nS电导范围中显示出1.83±0. 06nS的平均电导（_35mV，15mM Tris.HCl，pH值7. 5和150mMNaCl)。ClyA-CS开孔电导的分布显示了两个主峰：第一个包 含37%的重组纳米孔，与I型ClyA-CS对应（1.79±0.05nS);而第二个（II型ClyA-CS)包 含23%的纳米孔并显示2. 19±0. 09nS的平均电导（电导范围从2. 1-2. 4nS，图2b，中间）。 ClyA-WT和ClyA-AS也显示了小百分比的II型ClyA(分别为18%和16% )。ClyA-AS的单 一电导尤其与对应I型ClyA的52%的重组纳米孔一致（图2b，底部）。
[0075] 为了确定ClyA寡聚体的不同带是否与不同尺寸的纳米孔对应，从BN-PAGE中三个 主要的寡聚体带中提取ClyA-CS，对62个纳米孔的单一开孔纳米孔电导进行测量，所述62 个纳米孔源自凝胶萃取起两天内的每个带。来自最低带的62 %的ClyA-CS寡聚体形成I型 ClyA-CS纳米孔（1. 78 ±0. 04nS，图3a)，而68%的从第二最低带提取的纳米孔（图3b)重 组为II型ClyA-CS纳米孔（2. 19±2. 19nS)。感兴趣的是，42%的从第三带提取的纳米孔在 脂质双分子层中重组为第三类型纳米孔（III型ClyA)，其在2. 5-3.OnS电导范围内显示出 2. 81±0·llnS的平均电导（图3c)。
[0076] 综上所述，这些结果表明，在BN-PAGE中观察到的ClyA寡聚体的三个主要带对应 于三个不同的具有不同尺寸和不同单一电导的纳米孔类型。这一发现与高阶对称寡聚体结 构相对于亚基化学计量经常是自由的 13这一报道相一致。因此可以推测，I型ClyA最有可 能代表晶体结构的12聚体，而II型ClyA可能是在早期冷冻电镜研究中观察到的13聚体。 这两种纳米孔都显示了低电噪音（图8)并在宽的施加电势（+90mV到-150mV)范围内保 持打开。III型ClyA-CS纳米孔，其显示高于I型和II型纳米孔（图8)的噪音，并经常打 开和关闭尤其是在施加的电势低于_40mV和高于+50mV时；所述III型ClyA-CS纳米孔可 以对应于之前未观察到的ClyA的14聚体的变体。
[0077]实施例3.HT作为分子卡尺以测试不同尺寸的ClyA纳米孔[0078] 使用具有相同氨基酸组成但不同尺寸的纳米孔的能力是生物纳米孔领域的新特 性，所述能力是很重要的，因为纳米孔的尺寸限定了其捕获和研究特定分子的能力1(：b' 14。之 前已经揭示了 7a，-35mV，HT(人类凝血酶，37kDa)对于I型ClyA-SS纳米孔造成了非常明确 的的电流阻塞，其持续了几分钟。阻塞信号在两个电流水平，水平1(开孔纳米孔电流百分 比（IRES%) =56±1%)和水平2(IRES%=23±1%，表1和图4a)之间迅速切换，这反映出 HT在ClyA纳米孔的内腔中的两个停留位点。水平2最有可能与HT在深的位点处的停留相 关，而水平1与HT在接近纳米孔的顺式入口处的停留相关。7a因为凝血酶引起这样非常明 确的电流阻塞图案，因此本文使用HT作为分子卡尺来比较不同ClyA纳米孔的几何图形。
[0079] -35mV，HT对I型ClyA-CS纳米孔的电流阻塞与对I型ClyA-SS纳米孔的电流阻塞 是相同的（表1)，这证实了本文公开的变体中累积的突变最不可能改变ClyA纳米孔的尺寸 和几何形状。HT对II型ClyA的电流阻塞也在两个电流水平之间切换，但它们的相对分布 是不同的。在I型ClyA-CS中，HT主要停留在更靠近表面的结合位点处（占有率70%)，而 在II型ClyA-CS中，HT优选的结合位点在纳米孔内更深处（占有率96% )。这些结果表 明，这两种ClyA类型最有可能保持相似的整体纳米孔结构但对HT提供了不同的立体位阻。 HT对III型ClyA的阻塞较快（55±48ms)，并只显示水平2的电流阻塞（IRES%为32±9% )， 这表明III型ClyA足够大，允许HT无位阻地迀移穿过纳米孔（见下文）。
[0080] 实施例4.蛋白质穿过ClyA纳米孔的迀移
[0081] 凝血酶是一种球状蛋白，其分子体积接近直径为4. 2nm的球体（SI)。因此，假设 I型，II型和III型ClyA对应于具有不同寡聚体状态的纳米孔（见上文），HT应该不容易 迀移穿过I型和II型ClyA纳米孔（分别为3. 3和3. 7nm的反式直径，包括原子的范德瓦 尔斯半径，表1)。相反地，HT具有与III型ClyA相同的直径（表1)，这表明蛋白质可能能 够迀移穿过该纳米孔。一种用于评估分子是否穿过纳米孔的强有效的方法是研究蛋白质电 流阻塞的持续时间的电压依赖性。电流阻塞的持续时间随着电势的增加而减少是分子迀移 穿过纳米孔的强有力的证据。相比之下，电流阻塞的持续时间随着电压而增加表明，蛋白 质被驱到纳米孔中但没有迀移穿过所述纳米孔。 1Μ'15从_5mV到-25mV，HT对I型ClyA-SS 纳米孔的电流阻塞的停留时间随着施加的电势而增加（图9a)，这表明在该电压区间内HT 没有迀移穿过纳米孔。利用I型和II型进化而成的ClyA纳米孔在达到-150mV的施加电 势下保持打开这一事实，从_60mV到-150mV对I型和II型ClyA-CS纳米孔的HT阻塞进行 了特征。对I型ClyA-CS纳米孔施加高于-100mV的电势并对II型ClyA-CS纳米孔施加高 于-60mV的电势时，HT电流阻塞的停留时间随着电势的增加而急剧降低（图5a)，这表明在 此电势范围内HT分子迀移穿过纳米孔。类似地，Dendra2_M159A(FP，GFP样蛋白，30kDa蛋 白质）显示了一初始增加（从-25mV到-40mV)，之后电流阻塞（从-50mV到-70mV)的持 续时间减少，这表明在电势高于_50mV时FP迀移穿过I型ClyA-SS纳米孔（图9b)。在相 同电势下，HT对I型和II型ClyA-CS纳米孔的阻塞的持续时间的比较，显示了HT穿过II 型ClyA-CS的迀移比穿过I型ClyA-CS的迀移快了约两个数量级（图5b，表1)，这与I型 和II型ClyA描述了不同尺寸的纳米孔这一解释相符。
[0082] 实施例5.折叠迀移和展开迀移
[0083] 当分子停留在纳米孔的内腔中时，离子电流阻塞与被分子排除的电解质的原子体 积成比例。1(Η1Μ'16因此，如果分子以折叠结构迀移穿过纳米孔，则IRES%在不同施加电压下应 保持不变。相反，如果蛋白质在迀移时是展开的，则所述IRES%预计会变化，这表明展开的多 肽链的体积和形状不同于球状蛋白质。在_35mV至-150mV，HT迀移穿过I型和II型纳米 孔期间，所述IRES%值是相同的（水平2,表1)，这表明在这个电势范围内，HT在纳米孔内时 不展开。感兴趣的是，单独用I型ClyA-CS纳米孔时，在电势低于-90mv时，HT的电流阻塞 经常会以更高1_%的电流阻塞终止（肩值），之后，电流相对于开孔纳米孔的电流增加（尖 值）（图5c和10)。虽然在所述IRES%值时的肩值可能表明HT在迀移时是展开的，但是蛋白 质迀移后的电流