茯苓多糖活性组分和成分、其制备方法及用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药技术领域，涉及从巧冬中提取的多糖，具体涉及从中提取的多糖 组分A和B及多糖成分I和II及其药用组合物，本发明还涉及多糖组分A和B及多糖成分 I和II的制备方法，W及所述多糖组分或成分作为疫苗佐剂、疫苗辅料、免疫调节剂或用于 制备疫苗制剂、疫苗组合物或抗体的用途。
【背景技术】
[0002] 巧冬（Poria)为非權菌目（Aphyllo地orales)、多孔菌科（Polyporaceae)、巧冬属 (Poria)、真菌巧冬（Poria cocos(Schw. )Wolf.)的干燥菌核，具有利水渗湿、健脾、宁必之 功效（中国药典，2010版，p224)。
[0003] 近年来与本发明领域相关的研究和报道归纳如下：
[0004] 余建国等（余建国，等.中国兽医科技，2004,34(11) :70-74)给1日龄的维鸡腹 腔注射马立克氏病病毒（MDV)强毒株（0.2mL/只），并从当日开始给试验组维鸡W 1、2和 3mg/只的剂量连续肌肉注射巧冬多糖1周（未提及巧冬多糖的制备方法和理化性质）。结 果表明3个剂量巧冬多糖均可显著提高维鸡的淋己细胞转化率、NK细胞活性及ΜΦ活性。
[0005] 张志军等（张志军，等.中国免疫学杂志，2013,29 =1213-1216)将含60%巧冬多 糖混合物（还含有Η聰类化合物、己醜巧冬酸、巧冬酸、胆碱，3目-居基羊毛酱Η帰酸，葡萄 糖、腺嘿岭、组氨酸等）按0. 4、0. 8和1. 6mg/鼠的剂量灌胃给予小鼠一周。发现小鼠血清 中IgA、IgG和IgM水平高于生理盐水对照组，且存在剂量-效应关系。
[0006] 谢国秀等（谢国秀，等.生命科学研究，2009,13 (3) =246-248)将不同剂量 (200 μ g或1000 μ g)的巧冬多糖（未提及巧冬多糖的制备方法和理化性质）分别与低剂量 (0. 015 μ g)或高剂量（1. 5 μ g)流感病毒（A/PR/8)灭活疫苗共同免疫小鼠。一次免疫后3 周收集血清，检测血清中IgGJgGl和IgG2a的抗体水平，并用致死量（40XLD50)流感病毒 (A/PR/8)攻击小鼠。结果表明巧冬多糖能增加血清抗体水平，提高小鼠抗致死量流感病毒 攻击的能力，其免疫增强效果与氨氧化铅相当。
[0007] 王青等（王青，等.中国实验方剂学杂志，2011，17 (13) :127-130)观察巧冬多糖 (未提及巧冬多糖的制备方法和理化性质）对卵清白蛋白（OVA)诱导的小鼠肠道黏膜免疫 应答的影响。巧冬多糖每天按200mg/kg剂量灌胃给药小鼠，1周后1次灌胃抗原OVA 5mg， 对小鼠进行免疫，分别于免疫后1，2, 3周，收集小鼠粪便样本，ELISA检测小鼠粪便OVA特 异性分泌型免疫球蛋白A (sIgA)。结果表明巧冬多糖对肠道sIgA分泌具有促进作用，送与 其活化淋己结B淋己细胞有关。
[0008] Lee等化ee等.和汉医药学杂志，1999,16巧26) =175-182)在肺炎球菌gV型多糖 类蛋白质结合抗原接种小鼠前，预先注射当归多糖和巧冬多糖混合物0.2-1. Omg。结果表明 较未用多糖组gvPSIgG与IgM生成明显增加。中药多糖组小鼠用有毒力的19F型肺炎球菌 攻击后，血中的细菌迅速清除。用gV型肺炎球菌多糖类蛋白质结合抗原免疫小鼠的脾细胞 与中药多糖共育后，TNF- α的生成较对照组高4. 0-5. 5倍，IL-2高15-39倍，IL-4高4. 6~ 64倍。巧冬多糖还诱导IFN-Y生成增加。小鼠灌胃给予l、2、4g/L的巧冬多糖（含糖60% 混合物）7天，巧冬多糖组小鼠血清IgA、IgG和IgM水平高于生理盐水对照组，IgA、IgG和 IgM水平与巧冬多糖剂量呈正相关（张志军，等.中国免疫学杂志，2013, 29:1213-1215)。
[0009] 多糖成分及其它生物活性的文献报道
[0010] Lee 等（Xee, et al. International Immuno地armacology, 2004, 4:1029-1038)义 用1%碳酸钢提取巧冬，获得水提物。水提物经过己醇沉淀、DEAE-纤维素和Se地adex G-50 柱层析，获得一个分子量为8000化的糖肤（PCSC)，PCSC中糖与肤的百分比为78 ;22。糖部 分含有甘露糖（92%)、半乳糖化.2%)，阿拉伯糖（1.3%)。肤部分主要含有天冬氨酸、丝 氨酸和鄉氨酸。PCSC能显著活化RAW 264. 7巨瞻细胞，活化NF- K B/Rel和NO的分泌。化en 等（Qien,et al. Food and Qiemical Toxicology, 2004, 42:759-769)从巧冬中分离得到 1 个中性多糖组分（PC-P巧，分子量为160, OOODa (未提及理化性质）。PC-PS能抑制人白血病 U937细胞和化-60的增殖和分化，能提高TNF- α和IFN- Y的分泌。
[0011] 黄灿等（中华中医药学刊，2013, 31 (8) :1687-1689)采用热水煮沸提取巧冬多糖， 然后脱蛋白和采用不同浓度己醇醇沉得到3个不同分子量段的多糖组分（A、B、C)。A组分 由岩藻糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成，其摩尔比为：1.4 : 1.17 : 1 : 4.21 ;B组分由岩 藻糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成，其摩尔比为：1 : 2.36 : 5.49 : 2.34 ;C组分由岩藻 糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成，其摩尔比为：6 : 81 : 25 : 1。
[0012] Wang 等（Carbohy化ate Research, 2004, 339:327-334)分别采用 0. 9 % 化Cl(PCSl)、水煎煮（PCS2)、0. 5M 化0H(PCS3-I 和 PCS3-II)和 88 % 甲酸（PCS4-I 和PCS4-II)连续提取，制备了 6个多糖成分。其分子量分别为11.6X104(PCS1)、 20. 8X 1〇4 巧 CS2)、17. IX 104(PCS3-I)、9. IX 104(PCS3-II)、12. 3X 104(PCS4-I)和 21. 1X104(PCS4-II)。单糖组成如表1所示：
[001引 表1
[0014]
[001引没有检测J到；+ ;痕量。PCS3-II是线性（1 一扣-目-D-葡聚糖，PCS4-I含 目-(1 一 6)支链的（1 一 3)-目-D-葡聚糖。
[0017] Zhang 等（ONCOLOGY REPORTS, 2006, 15:637-643)从巧冬菌丝体中分离得到一个 多糖成分（PCM3-II)，是一种（1 一 3)和（1 一 4)目-葡聚糖。PCM3-II对肺癌细胞有明显 抑制活性。
[0018] 综合W上文献可W看出；（1)巧冬多糖具有疫苗佐剂作用，但文献均未明确阐明 使用的巧冬多糖具体制备方法、理化性质及化学结构特征，而不同制备方法得到的巧冬多 糖其理化性质可能差别很大。（2)仅有2篇文献报道了巧冬多糖成分，均为目-葡聚糖，然 而其它从巧冬分离得到的杂多糖均无化学结构的研究。
[0019] 本发明采用不同于现有技术的方法最终从巧冬药材中分离、纯化获得具有免疫佐 剂活性的2个多糖组分和2个多糖成分，并对其进行理化性质、化学结构W及疫苗佐剂活性 的研究。
【发明内容】
[0020] 本发明提供了从中药材巧冬或巧冬菌丝体中分离得到的巧冬多糖组分A和BW及 巧冬多糖成分I和II及其药用组合物、其制备方法；W及所述巧冬多糖组分或成分作为疫 苗佐剂、疫苗辅料或免疫调节剂，或用于制备疫苗制剂、疫苗组合物或抗体中的用途。具体 地，
[0021] 本发明第一方面涉及巧冬多糖组分，其选自W下多糖组分中的一种或两种：
[002引 1)多糖组分A，其含糖的重量百分比为50-80 %，例如为50-70 %，例如为50-60 %， 例如为55-60%，其含有岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其中岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半 乳糖的相对摩尔比为1. 0 ; (1. 0~3. 0) : (0. 1~1. 5) : (3. 0~9. 0);
[0023] 2)多糖组分B，其含糖的重量百分比为50-80 %，例如为50-70 %，例如为55-65 %， 例如为57-62%，其含有岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其中岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半 乳糖的相对摩尔比为1. 0 ; (1. 0~3. 0) : (0. 1~5. 5) : (3. 0~10. 0)。
[0024] 根据本发明第一方面任一项的巧冬多糖组分，其中多糖组分A含糖的重量百分比 为 56-59%。
[00巧]根据本发明第一方面任一项的巧冬多糖组分，其中多糖组分B含糖的重量百分比 为 59-61%。
[0026] 根据本发明第一方面任一项的巧冬多糖组分，其中多糖组分A中岩藻糖、甘露糖、 葡萄糖和半乳糖的相对摩尔比为1. 0 ; (1. 5~2. 5) : (0. 2~0. 8) : (4. 0~8. 0)，例如为 1. 0 : (1. 6 ~1. 8) ; (0. 4 ~0. 6) ; (4. 5 ~6. 5)。
[0027] 在本发明的实施方案中，所述多糖组分A中岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的相 对摩尔比为 1. 0 ;1. 68:0. 50:5. 22。
[0028] 根据本发明第一方面任一项的巧冬多糖组分，其中多糖组分B中岩藻糖、甘露糖、 葡萄糖和半乳糖的相对摩尔比为1. 0 ; (1. 3~2. 5) : (3. 5~5. 0) : (4. 0~9. 0)，例如为 1. 0 ; (2. 1 ~2. 3) ; (4. 3 ~4. 7) ; (7. 0 ~7. 5)。
[0029] 在本发明的实施方案中，所述多糖组分B中岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的相 对摩尔比为 1. 0 ;2. 20:4. 48:7. 20。
[0030] 根据本发明第一方面任一项的巧冬多糖组分，其中多糖组分A的峰高分子量约 为28210Da，其分子量范围为1.0Xl〇4~6. 0Χ10403,例如1.0Xl〇4~5. 0Χ10403,再例 如2. 0Χ 104~4. 5Χ 104Da。多糖组分Β的峰1的峰高分子量约为28582Da，其分子量范围 为 1. ο X 1〇4 ~6. ο X 1〇4〇日，例如 1. ο X 1〇4 ~5. ο X 1〇4〇日，再例如 2. ο X 1〇4 ~5. ο X 10403 ; 峰2的峰高分子量644500Da，其分子量范围为2. ΟΧ1〇5~10. 0Χ10503,例如4. ΟΧ1〇5~ 8. 0X10?Da〇
[0031] 在本发明的一个具体实施方案中，所述多糖组分A为PCP-A。
[0032] 在本发明的一个具体实施方案中，所述多糖组分B为PCP-B。
[0033] 本发明第二方面涉及巧冬多糖成分，其选自W下多糖成分中的一种或两种：
[0034] (1)多糖成分I，其含有岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其中岩藻糖、甘露糖、葡 萄糖和半乳糖的相对摩尔比为1. 0 ; (1. 0~2. 5) : (0. 1~1. 0) : (3. 0~9. 0);
[0035] (2)多糖成分II，其含有岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其中岩藻糖、甘露糖、葡 萄糖和半乳糖的相对摩尔比为1. 0 ; (0. 5~3. 0) ; (0. 05~1. 0) : (3. 0~10. 0)。
[0036] 根据本发明第二方面任一项的巧冬多糖成分，其中多糖成分I中岩藻糖、甘露糖、 葡萄糖和半乳糖的摩尔比为1.0 :(1.0~2. 5) :(0.1~1.0) :(3. 0~9.0)，例如为1.0: (1. 2 ~2. 0) ; (0. 1 ~0. 5) ; (5. 0 ~8. 0)，例如为 1. 0 ; (1. 7 ~1. 9) ; (0. 2 ~0. 3) ; (7. 0 ~ 7.巧。
[0037] 在本发明的实施方案中，所述多糖成分I中岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的摩 尔比为 1. 0 ;1. 81 ;0. 27 ;7. 27。
[003引根据本发明第二方面任一项的巧冬多糖成分，其中多糖成分II中岩藻糖、甘露糖、 葡萄糖和半乳糖的摩尔比为1. 0 ; (1. 0~3. 0) ; (0. 05~0. 8) : (3. 0~9. 0)，例如为1. 0 : (1. 3 ~1. 9) ; (0. 1 ~0. 4)