一种获得栉孔扇贝凋亡抑制蛋白基因编码全序列的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物信息和分子生物学领域，具体说是一种获得栉孔扇贝凋亡抑制蛋 白基因编码区全序列的方法。
【背景技术】
[0002] 细胞凋亡，也称为程序性细胞死亡，是由生物体中多种基因精确调控的一种细胞 死亡方式，在生长、发育、免疫、稳态维系等诸多生物学过程中起重要作用。凋亡抑制蛋白是 重要的凋亡调控蛋白，广泛存在于多种生物体中，在哺乳动物尤其是人类中研究较为深入。 凋亡抑制蛋白家族成员除可对生物体中多种生物学过程中细胞凋亡起到抑制作用外，也参 与细胞周期、免疫反应等过程的调控。在人类中，由于凋亡抑制蛋白过量表达于癌症细胞 中，因此在癌症机制、分子靶向药物研制及治疗等方面成为一个研究热点。
[0003] 栉孔扇贝是我国重要养殖贝类，但是其基础研究相对薄弱，目前尚无凋亡抑制蛋 白基因序列的研究报道。通过传统的基因末端扩增法获取栉孔扇贝凋亡抑制蛋白基因序 列，存在一定的难度，主要表现为：1)从大量转录组序列中筛查目标基因片段费时费力；2) 缺乏栉孔扇贝凋亡抑制蛋白基因编码片段，无法进行后续的引物设计；3)通过传统的借助 商业试剂盒进行基因末端扩增法获得基因序列效率较低，费用较高。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种获得栉孔扇贝凋亡抑制蛋白基因编码全序列的方法。
[0005] 为实现上述目的本发明采用的技术方案为：
[0006] -种获得栉孔扇贝凋亡抑制蛋白基因编码全序列的方法，从NCBI获得栉孔扇贝 转录组表达序列，对获得的序列进行拼接组装处理，处理后获得局部比对数据库，利用已知 现有生物报道的凋亡抑制蛋白序列与上述局部比对数据库进行比对获得栉孔扇贝凋亡抑 制蛋白基因编码片段；
[0007] 利用上述获得栉孔扇贝凋亡抑制蛋白基因编码片段根据基因片段设计扩增引物 YF1和YF2,获得栉孔扇贝凋亡抑制蛋白基因编码区序列；
[0008] 根据获得栉孔扇贝凋亡抑制蛋白基因编码区序列的5'端和3'端，设计相应的扩 增引物，分别进行凋亡抑制蛋白基因编码序列的5'端和3'端延伸扩增，扩增后利用重叠片 段法进行连接，获得栉孔扇贝凋亡抑制蛋白基因编码区全长序列。
[0009] 所述弓丨物YF1序列为' AGGGCTGGCCGAAATCAGATAGA'，弓丨物YF2序列 为 ' TGGAAAATGGCGGTAATGCTCAA'。
[0010] 所述扩增栉孔扇贝凋亡抑制蛋白基因编码区序列的5'端序列的引物K5R1序列 为 ' CGTGAAGCACACCACCACAGTA'，引物 K5R2 序列为 ' TGAACTCTGTCTTTTTCCCCTA'。
[0011] 所述扩增栉孔扇贝凋亡抑制蛋白基因编码区序列的3'端序列的引物K3F1序列 为 ' TGTCAACAAACACCAAATGTCCCAG'，引物 K3F2 序列为 ' TTCACACAATCGACAGTTAGGGAAC'。
[0012] 所述凋亡抑制蛋白基因编码序列的5'端和3'端延伸扩增是以栉孔扇贝cDNA序 列为模板，进行巢式PCR扩增。
[0013] 本发明具有以下优点：
[0014] 1.本发明针对当前已有大量公开发布的栉孔扇贝表达序列可供免费检索，获得利 用已公开序列建立基因搜索数据库，降低了获得基因序列的难度。
[0015] 2.本发明提供的方法中生物信息分析过程对计算系统要求低，结果准确，提高了 后续引物设计的可靠性。
[0016] 3.本发明结合生物信息分析和传统分子生物学实验手段，能简单，高效，低成本地 获得栉孔扇贝凋亡抑制蛋白基因编码区序列。
[0017] 4.本发明提供的方法能快速经济获得栉孔扇贝凋亡抑制蛋白相关基因编码序列。 数据库构建步骤简单快速，对运算系统要求低，可完全本地化操作；后续扩增测序利用常规 分子生物实验方法和试剂，简单易行，结果可靠。
【附图说明】
[0018] 图la、lb、lc、ld为本发明实施例提供的采用本发明方法获得的栉孔扇贝凋亡抑 制蛋白基因1编码全序列图、结构域归类和结构域功能注释，全序列全长为756bp。
[0019] 图2a、2b、2c、2d为本发明实施例提供的采用本发明方法获得的栉孔扇贝凋亡抑 制蛋白基因2编码全序列、结构域归类和结构域功能注释，全序列全长为1071bp。
[0020] 图3a、3b、3c、3d为本发明实施例提供的采用本发明方法获得的的栉孔扇贝凋亡 抑制蛋白基因3编码全序列、结构域归类和结构域功能注释，全序列全长为729bp。
【具体实施方式】
[0021] 下面以获得栉孔扇贝凋亡抑制蛋白基因的编码序列为实例，对本发明作进一步的 阐述。
[0022] 实施例1
[0023] 栉孔扇贝凋亡抑制蛋白基因 1编码全序列的获得。
[0024] 1)从 NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)中获得柿孔扇贝表达序列，计 1，222, 461 条。
[0025] 2)去除掉小于100bp和包含不确定碱基' Ν'的序列后，将剩余的1，058, 961条序 列；利用CAP3对这些序列进行拼接组装，命令为' CAP3ZK_RAW. fasta-o 50-ρ 95'，共获得 contig 序列 79, 617 条，singlet 序列 571，539 条，即总共获得 UniGene 序列 651，156 条。
[0026] 3)将步骤2)获得的UniGene序列通过运行BLAST工具包中的F0RMATDB命令，获 得栉孔扇贝UniGene局部比对数据库，具体运行参数为'F0RMATDB-i UniGene-p F'。
[0027] 4)利用现有牡蛎已公布48条凋亡抑制蛋白序列，借助BLAST工具包中 的BLASTALL命令和上述获得的UniGene局部比对数据库进行比对，具体命令参数 为 ' BLASTALL-i oyster48. fasta-d UniGene-p tBLASTn-e le 5-〇 ΖΚ· IAP. fragment，。而 后将获得序列中的E值低于le 且对牡蛎凋亡抑制蛋白基因编码序列覆盖率大于50%的 序列初步确定为栉孔扇贝凋亡抑制蛋白基因编码片段。
[0028] 5)根据上述确定的栉孔扇贝凋亡抑制蛋白基因编码片段设计扩增 引物 YF1 和 YF2，其中 YF1 序列为 'AGGGCTGGCCGAAATCAGATAGA'，YF2 序列 为 ' TGGAAAATGGCGGTAATGCTCAA' ；扩增后测序获得序列 ' AGGGCTGGCCGAAATCAGATAGATTAAAA TCGGAACTAATTTTGGATGGGTTTTTTTACCTAGGGGAAAAAGACAGAGTTCAATGTGCTTACTGTGGTGGTGTGCT TCACGGTTTTGAAGAAGATGATAATGTACACATTGAGCATTACCGCCATTTTCCA'，利用 EMBL 的 INTERPRO 程序预测序列结构域并进行家族归类，利用NCBI的BLAST程序进行序列结构域和功能注 释，发现序列含有凋亡抑制蛋白的BIR特征结构域，并可归类为BIR超家族，因此可确定获 得栉孔扇贝凋亡抑制蛋白基因编码片段。
[0029] 6)根据上述获得的栉孔扇贝凋亡抑制蛋白基因编码区序列设计5'端扩 增引物 K5R1 和 K5R2，其中 K5R1 序列为 'CGTGAAGCACACCACCACAGTA'，K5R2 序列 为' TGAACTCTGTCTTTTTCCCCTA'，以栉孔扇贝cDNA序列为模板，进行巢式PCR扩增，扩增体系 和条件为，cDNA模板50ng，引物分别为5pmol，Taq酶1U，95°C加热lOmin后，进行30个热 循环，其中每个循环包括95°C加热30s，60°C加热40s，72°C加热30s，最后72°C加热lOmin。 第一轮扩增产物稀释10倍后，以上述相同条件进行第二轮扩增。获得栉孔扇贝凋亡抑制蛋 白基因编码区 5' 端序列 'ATGTGTGGTATAACTGGGCTATGTGTTAATTGTAAAAAGGTTACATCAGGTATGC ATCAAGTTCCAGGAAGGGATATTGTCCCTCCGCGGCCCATAGAAAGGTACAGACACCTCCGCGACACAGACACCAGA ACAAGAACGTACAAGGGCTGGTTGAAATCAGATAAATTAAAATCGGAACTAATTTTGGATGGGTTTTTTTACCTAGG GGAAAAAGACAGAGTTCAATGTGCTTACTGTGGTGGTGTGCTTCACG' ；
[0030] 7)根据获得的栉孔扇贝凋亡抑制蛋白基因编码区序列设计3'端扩增 引物 K3F1 和 K3F2，其中 K3F1 序列为 'TGTCAACAAACACCAAATGTCCCAG'，K3F2 序列 为' TTCACACAATCGACAGTTAGGGAAC'以栉孔扇贝cDNA序列为模板，进行巢式PCR扩增，扩增 体系和条件为，cDNA模板50ng，引物分别为5pmol，Taq酶1U，95°C加热lOmin后，进行30 个热循环，其中每个循环包括95°C加热30s，6(TC加热40s，72°C加热30s，最后72°C加热 lOmin。第一轮扩增产物稀释10倍后，以上述相同条件进行第二轮扩增。获得栉孔扇贝凋 亡抑制蛋白基因编码区 3' 端序列 ' CTTACTGTGGTGGTGTGCTTCACGGTTTTGAAGAAGATGATAATGTA CACATTGAG