条，singlet 序列 571，539 条，即总共获得 UniGene 序列 651，156 条。
[0046] 3)将步骤2)获得的UniGene序列通过运行BLAST工具包中的F0RMATDB命令，获 得栉孔扇贝UniGene局部比对数据库，具体运行参数为'F0RMATDB-i UniGene-p F'。
[0047] 4)利用现有牡蛎已公布48条凋亡抑制蛋白序列，借助BLAST工具包中 的BLASTALL命令和上述获得的UniGene局部比对数据库进行比对，具体命令参数 为 ' BLASTALL-i oyster48. fasta-d UniGene-p tBLASTn-e le 5-〇 ΖΚ· IAP. fragment，。而 后将获得序列中的E值低于le 且对牡蛎凋亡抑制蛋白基因编码序列覆盖率大于50%的 序列初步确定为栉孔扇贝凋亡抑制蛋白基因编码片段。
[0048] 5)根据栉孔扇贝凋亡抑制蛋白基因编码片段设计扩增引物YF1和YF2,其中YF1 序列为 ' CACCAAAACAACGATACCAGCA'，YF2 序列为 ' CACAAATCATCAACTCTGCGT' ；扩增后测序获 得序列 ' CAAAACAACGATACCAGCATTTGAGGGACCCAGATTTACGAAAAAGGAGTTTTGGAAAGTGGCAGAAATA TACCGAGCAGTTTATAAAGGAACTTGTTGACGATGGCTTGTTCAGCATAGACGAAGAGAAACGGAAAGTTCAGTGTG TGTACTGTGGTGGAGTTCTTTGTGGCGTTGAAGAAGGACAAAAAATCCACATCACACATTATCGTCATTTTCCTAAA TGTGACAGGTTTAAGTACAGAGAACCAGACTTTTTAAATCTTTTCAAAAATGCTCTGGCTAACAGTGACGCGACTGT AGCAGACGGTGAGACTGGAACAATGGATGTTACACCTTATATAATAGGTAAAAACGGAGCTGGCGAGGGGTACTACT TAGACGGGAGGGGGCAGGATACATCACATTCTGTTTACGTGCAAGGGGACACGACATATCCTAAACACATCTATTAT TCCATGTACATAGACAGATTAAGAACCTTCAAGAATTGGCCAGCACATTCTAAACAGACACCAGAAGAACTTGCTAG AGTTGGGTTTTTTTACGCAGGAGTTGATGATT'，利用 EMBL 的 INTERPR0 程序预测序列结构域并进行 家族归类，利用NCBI的BLAST程序进行序列结构域和功能注释，发现序列含有凋亡抑制蛋 白的BIR特征结构域，并可归类为BIR超家族，因此可确定获得栉孔扇贝凋亡抑制蛋白基因 编码片段。
[0049] 6)根据上述获得的栉孔扇贝凋亡抑制蛋白基因编码区序列设计5'端 扩增引物 K5R1 和 K5R2，其中 K5R1 序列为 'AAGTCTGGTTCTCTGTACTT'，K5R2 序列 为' GTCTATGCTGAACAAGCCAT'，以栉孔扇贝cDNA序列为模板，进行巢式PCR扩增，扩增体系 和条件为，cDNA模板50ng，引物分别为5pmol，Taq酶1U，95°C加热lOmin后，进行30个热 循环，其中每个循环包括95°C加热30s，60°C加热40s，72°C加热30s，最后72°C加热lOmin。 第一轮扩增产物稀释10倍后，以上述相同条件进行第二轮扩增。获得栉孔扇贝凋亡抑制蛋 白基因编码区 5' 端序列 'ATGGATATTGCTCCTCCGCCACCAAAACAACGATACCAGCAITTGAGGGACCCAG ATTTACGAAAAAGGAGTTTTGGAAAGTGGCAGAAATATACCGAGCAGTTTATAAAGGAACTTGTTGACGATGGCTTG TTCAGCATAGACGAAGAGAAACGGAAAGTTCAGTGTGTGTACTGTGGTGGAGTTCTTTGTGGCGTTGAAGAAGGACA AAAAATCCACATCACACATTATCGTCATTTTCCTAAATGTGACAGGTTTAAGTACAGA' ；
[0050] 7)根据获得的栉孔扇贝凋亡抑制蛋白基因编码区序列设计3'端扩增引物K3F1和 K3F2,其中 K3F1 序列为 ' TGGCTTGTTCAGCATAGACGA'，K3F2 序列为 ' GGITTAAGTACAGAGAACCA' 以栉孔扇贝cDNA序列为模板，进行巢式PCR扩增，扩增体系和条件为，cDNA模板50ng，引物 分别为5pmol，Taq酶1U，95°C加热lOmin后，进行30个热循环，其中每个循环包括95°C加 热30 8,601：加热408,721：加热308，最后721：加热101^11。第一轮扩增产物稀释10倍后， 以上述相同条件进行第二轮扩增。获得栉孔扇贝凋亡抑制蛋白基因编码区3'端序列' TTAA ATCTTTTCAAAAATGCTCTGGCTAACAGTGACGCGACTGTAGCAGACGGTGAGACTGGAACAATGGATGTTACACCT TATATAATAGGTAAAAACGGAGCTGGCGAGGGGTACTACTTAGACGGGAGGGGGCAGGATACATCACATTCTGTTTA CGTGCAAGGGGACACGACATATCCTAAACACATCTATTATTCCATGTACATAGACAGATTAAGAACCTTCAAGAATT GGCCAGCACATTCTAAACAGACACCAGAAGAACTTGCTAGAGTTGGGTTTTTTTACGCAGGAGTTGATGATTTGTGC GAGTGCTACTGCTGTGGTGGTCAACTGGATGAATGGGAAGATGGTGATGACCCGAAGCAAGAACATGACAGGTGGTT TTCCGATATATGTCCATTATACAAAGCAAGACAGAGGCGATTATCAGCTCAGGTCGGATGA ,；
[0051] 8)将步骤5)、6)和7)获得的序列利用现有的重叠片段法进行连接，利用EMBL的 INTERPRO程序预测序列结构域并进行家族归类，利用NCBI的BLAST程序进行序列结构域和 功能注释，发现序列含有凋亡抑制蛋白的BIR特征结构域，可归类为BIR超家族，且基因注 释为IAP，因此可确定获得栉孔扇贝凋亡抑制蛋白基因编码区全长序列（见附图3a-d)。
【主权项】
1. 一种获得栉孔扇贝凋亡抑制蛋白基因编码全序列的方法，其特征在于：从NCBI获得 栉孔扇贝转录组表达序列，对获得的序列进行拼接组装处理，处理后获得局部比对数据库， 利用已知现有生物报道的凋亡抑制蛋白序列与上述局部比对数据库进行比对获得栉孔扇 贝凋亡抑制蛋白基因编码片段； 利用上述获得栉孔扇贝凋亡抑制蛋白基因编码片段根据基因片段设计扩增引物YF1 和YF2,获得栉孔扇贝凋亡抑制蛋白基因编码区序列； 根据获得栉孔扇贝凋亡抑制蛋白基因编码区序列的5'端和3'端，设计相应的扩增引 物，分别进行凋亡抑制蛋白基因编码序列的5'端和3'端延伸扩增，扩增后利用重叠片段法 进行连接，获得栉孔扇贝凋亡抑制蛋白基因编码区全长序列。2. 按权利要求1所述的获得栉孔扇贝凋亡抑制蛋白基因编码全序列的方法， 其特征在于：所述引物YF1序列为' AGGGCTGGCCGAAATCAGATAGA'，引物YF2序列 为 ' TGGAAAATGGCGGTAATGCTCAA'。3. 按权利要求1所述的获得栉孔扇贝凋亡抑制蛋白基因编码全序列的方法，其特征 在于：所述扩增栉孔扇贝凋亡抑制蛋白基因编码区序列的5'端序列的引物K5R1序列 为 ' CGTGAAGCACACCACCACAGTA'，引物 K5R2 序列为 ' TGAACTCTGTCTTTTTCCCCTA'。4. 按权利要求1所述的获得栉孔扇贝凋亡抑制蛋白基因编码全序列的方法，其特征 在于：所述扩增栉孔扇贝凋亡抑制蛋白基因编码区序列的3'端序列的引物K3F1序列 为 ' TGTCAACAAACACCAAATGTCCCAG'，引物 K3F2 序列为 ' TTCACACAATCGACAGTTAGGGAAC'。5. 按权利要求1所述的获得栉孔扇贝凋亡抑制蛋白基因编码全序列的方法，其特征在 于：所述凋亡抑制蛋白基因编码序列的5'端和3'端延伸扩增是以栉孔扇贝cDNA序列为 模板，进行巢式PCR扩增。
【专利摘要】本发明涉及生物信息和分子生物学领域，具体说是一种获得栉孔扇贝凋亡抑制蛋白基因编码区全序列的方法。从NCBI获得栉孔扇贝转录组表达序列，对获得的序列进行拼接组装处理，处理后获得局部比对数据库，利用已知现有生物报道的凋亡抑制蛋白序列与上述局部比对数据库进行比对获得栉孔扇贝凋亡抑制蛋白基因编码片段；利用上述获得栉孔扇贝凋亡抑制蛋白基因编码片段根据基因片段设计扩增引物YF1和YF2，获得栉孔扇贝凋亡抑制蛋白基因编码区序列；根据获得栉孔扇贝凋亡抑制蛋白基因编码区序列的5ˊ端和3ˊ端，设计相应的扩增引物，分别进行凋亡抑制蛋白基因编码序列的5ˊ端和3ˊ端延伸扩增，扩增后利用重叠片段法进行连接，获得栉孔扇贝凋亡抑制蛋白基因编码区全长序列。本发明提供的方法能快速经济获得栉孔扇贝凋亡抑制蛋白相关基因编码序列。
【IPC分类】C12N15/10
【公开号】CN105624145
【申请号】CN201410620497
【发明人】亓海刚, 苗国英, 李莉, 阙华勇, 张国范
【申请人】中国科学院海洋研究所
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2014年11月6日