用于鉴定肝损伤的生物标记的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求于2012年10月24日提交的美国临时申请号61/717,977的优先权， 其整个公开内容通过引用结合在本文中。
技术领域
[0003] 现在公开的本发明一般地涉及免疫分析物作为用于鉴定哺乳动物中的肝损伤和/ 或预测患有肝损伤的哺乳动物的存活性的生物标记的应用。
[0004] 发明背景
[0005] 由药物和化学剂引起的肝损伤是流行性和重要性持续增加的问题。在美国，药物 诱发的肝损伤（drug induced liver injury，DILI)是急性肝衰竭的常见原因，其占此类病 例的约13% (1-3)。DILI还是导致另外有希望的新药候选物的放弃或导致新药经常仅在使 用几个月后就从市场上召回的最常见的不利药物事件。此类事件不仅在发展DILI的人所 经历的疼痛、折磨和死亡方面具有明显和主要的人类代价，并且对已经开发了这些药物的 公司、对他们的股东以及对整个社会也具有重大的经济代价，因为用于开发此类遭恶运的 药物的资源本可以更好地花费在其他措施上以改善我们的健康和福利（4-7)。
[0006] DILI的流行性混杂着草药药物和膳食补充剂（HDS)的日益增长的使用。由于它们 是"天然的"，因此这些通常被认为是安全的。然而，清楚的是，这些中的很多都可能引起严 重的肝损伤。近年来，在美国，约10%的DILI病例已经涉及HDS (10)，在远东甚至报道了更 高的频率（11)。
[0007] 除了 DILI之外，哺乳动物的肝脏可能以多种其他方式受损，包括由于病毒感染引 起的炎症（例如，甲型、乙型、丙型或戊型肝炎），胆管堵塞，胆固醇或甘油三酯累积，和流向 肝脏的血液流动受损。
[0008] 不管其病因学，肝损伤可能难以诊断。对于肝损伤常用的生物标记，如血清氨基转 移酶、碱性磷酸酶和其他酶，具有有限的灵敏性和特异性（7, 9)。此外，提供肝损伤的准确的 预后甚至要更困难。对于患有急性肝衰竭的患者，没有可靠的检测能够预测近期内（例如， 六个月的时间期间）是否有必要进行肝移植。由于移植手术的有限的肝脏供应，因此，区分 近期内需要移植的患者与近期内不需要移植的患者是至关重要的。
[0009] 因此，亟需用于准确检测肝损伤并且预测患有威胁生命的肝损伤的受试者在给定 时间期间内的存活性的方法和试剂盒。
[0010] 发明概述
[0011] 本发明提供表征个体，如哺乳动物（例如，人）中的肝损伤的方法。例如，所述方 法可以用于区分经历威胁生命的肝损伤的个体与经历不威胁生命的肝损伤的个体。所述方 法还可以用于监测有肝损伤危险（例如，由于DILI、病毒性肝炎、自体免疫性肝炎、缺血性 肝炎等）的个体，并且确定该个体是否可能经历威胁生命的肝衰竭和在特定的时间期间内 是否需要肝移植。本发明特别是基于免疫学标记（即，免疫分析物和血清白蛋白）的成功 鉴定，所述免疫学标记在其血液浓度水平上表现出与增加的威胁生命的肝损伤的危险相关 的协调变化。
[0012] 因此，在一方面，本发明提供表征个体中的肝损伤的方法。在某些实施方案中，所 述方法包括直接或间接获得来自个体的血液样品中的血清白蛋白的浓度。然后，将得到的 血清白蛋白的浓度与预先确定的血清白蛋白的浓度（例如，3. 5g/dL，3. 2g/dL或2. 8g/dL) 进行比较。在某些实施方案中，所述方法包括直接或间接获得来自个体的血液样品中一 种或多种免疫分析物的浓度，所述免疫分析物选自由以下组成的组：TNFa，IL-12, IL-17， IL-4, IL-5, IL-13, IL-9，MIP-1 0，RANTES，FGF b，PDGF-bb 和 IL-6。然后，将这样得到的一 种或多种免疫分析物的浓度与在健康个体（例如，具有健康的肝脏的个体）的血液中发现 的该免疫分析物的浓度相比较。在某些实施方案中，如果（1)所述个体的血清白蛋白浓度 小于或等于预先确定的血清白蛋白的浓度（例如，2. 8g/dL)，并且（2)所述个体血液中所述 一种或多种免疫分析物的浓度小于健康个体血液中相对应的免疫分析物的中值浓度（然 而，对于IL-6,适用的条件是个体血液中的浓度大于健康个体血液中IL-6的中值浓度），则 所述个体被鉴定为具有威胁生命的肝损伤。在某些实施方案中，如果所述个体血清白蛋白 的浓度大于预先确定的血清白蛋白的浓度（例如，2. 8g/dL)，和/或所述个体血液中至少一 个得到的免疫分析物浓度不小于健康个体血液中相对应的免疫分析物的中值浓度（然而， 对于IL-6,适用的条件是个体血液中的浓度不大于健康个体血液中IL-6的中值浓度），则 所述个体被鉴定为具有不威胁生命的肝损伤。
[0013] 在某些实施方案中，所述方法进一步包括通知所述个体其已经被鉴定具有威胁生 命的肝损伤。在其他实施方案中，所述方法还包括通知所述个体其已经被鉴定为具有不威 胁生命的肝损伤。在某些实施方案中，所述方法进一步包括为所述个体提供与所述个体的 鉴定状态（即，具有威胁生命的或不威胁生命的肝损伤）相一致的医学护理。例如，在某些 实施方案中，所述方法还包括：如果所述个体被鉴定具有威胁生命的肝损伤，则对所述个体 开皮质类固醇（例如，泼尼松（prednisone))的步骤。在其他实施方案中，所述方法还包括 如果所述个体被鉴定具有威胁生命的肝损伤，则对所述个体推荐肝移植程序的步骤。在某 些实施方案中，所述方法还包括如果所述个体被鉴定具有威胁生命的肝损伤，则对所述个 体进行肝移植的步骤。
[0014] 本发明的方法中所用的血液样品可以是血清样品。备选地，所述血液样品可以是 血浆样品。通常，应该将为所述个体确定的免疫分析物的浓度与由相同类型的样品确定的 浓度（例如，中值浓度）进行比较（例如，个体血清中的IL-17浓度应该与在来自健康个体 的血清样品中检测到的IL-17的中值浓度进行比较）。在优选的实施方案中，所述个体是哺 乳动物，如人。
[0015] 在优选的实施方案中，直接或间接获得一种或多种免疫分析物的浓度包括获得选 自由以下组成的组的至少三种、更优选四种免疫分析物的浓度：TNF a，IL-12, IL-17, IL-4， IL-5, IL-13, IL-9, MIP-1 0，RANTES，FGF b，PDGF-bb 和 IL-6。优选地，所述方法包括获得 IL-17、RANTES和/或H)GF bb的浓度。优选地，所述方法包括获得IL-17、RANTES和/或 TOGF bb的浓度，和获得选自由IL-4、IL-13、IL-9和FGF b组成的组的至少一种另外的免 疫分析物的浓度。在某些实施方案中，所述方法包括获得IL_17、RANTES和/或TOGF bb以 及TNF a和FGF b二者的浓度。任意前述方法可以进一步包括获得来自个体的血液样品中 的IL-6的浓度。如本文其他地方所讨论的，大于健康个体中的IL-6中值浓度的IL-6浓度 与具有威胁生命的肝损伤的个体相一致。
[0016] 在相关方面中，本发明提供评估临床试验所招募的受试者中的肝损伤的方法。所 述方法可以以上文和本文其他地方所述的表征个体中肝损伤的方法的方式进行。然而，在 某些实施方案中，所述评估临床试验所招募的受试者中的肝损伤的方法包括鉴定所述受试 者为具有威胁生命的肝损伤、不危险生命的肝损伤或正常的肝功能的步骤。威胁生命的肝 损伤和不威胁生命的肝损伤如上文和本文其他地方所述进行鉴定。例如，如果（i)从所述 受试者血液样品得到的血清白蛋白浓度值大于预先确定的血清白蛋白浓度（例如，2. 8g/ dL，3.2g/dL，或3.5g/dL)，并且（ii)由受试者血液样品得到的所述一种或多种免疫分析物 的浓度全部大于或等于健康受试者中血液中相对应的免疫分析物的中值浓度（然而，对于 IL-6,适用条件是个体血液中的浓度小于或等于健康个体血液中IL-6的中值浓度），可以 鉴定正常的肝功能。
[0017] 在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，如人。在某些实施方案中，所述临床 试验是用于新药（例如，抗癌药或抗炎药）。在某些实施方案中，所述受试者有DILI的危 险。
[0018] 在另一方面中，本发明提供评估患有肝损伤的个体的存活性的方法。典型地，所述 个体是哺乳动物，如人。在某些实施方案中，所述方法包括直接或间接获得来自所述个体的 血液样品（例如，血清样品）中血清白蛋白的浓度。在某些实施方案中，所述方法包括直 接或间接获得来自所述个体的血液样品（例如，血清样品）中一种或多种免疫分析物的浓 度，所述免疫分析物选自由以下组成的组：TNFa，IL-12, IL-17, IL-4, IL-5, IL-13, IL-9， MIP-10，RANTES，FGF b，H)GF-bb和IL-6。在获得目的免疫分析物的浓度后，在个体基础上， 将所述值与在健康个体（例如，具有健康的肝脏的个体）血液中发现的相对应的免疫分析 物的中值浓度进行比较。按照本发明的某些实施方案，所述方法包括确定由患者血液样品 获得的一种或多种免疫分析物的浓度是否小于健康个体的所述免疫分析物的中值浓度的 步骤（然而，对于IL-6,适用的条件是个体血液中的浓度大于健康个体血液中IL-6的中值 浓度）。除了比较目的免疫分析物的测量值之外，由个体血液样品获得的血清白蛋白的浓度 还与预先确定的浓度范围或截点值（例如，2-5g/dL，2-4g/dL，2-3g/dL，2. 5-3g/dL或2. 8g/ dL)进行比较，并且确定所述个体的血清白蛋白浓度是（i)小于所述浓度范围（或小于或等 于预先确定的截点值），还是（ii)在所述浓度范围之内（或大于预先确定的截点值）。
[0019] 在某些实施方案中，所述方法包括鉴定个体具有从肝损伤存活的高可能性（例 如，有90%以上的机会再活六个月）或死于肝损伤的高可能性（例如，有90%以上的机会 在接下来的六个月内死亡，除非进行肝移植）的步骤。可以基于测量的免疫分析物浓度和 血清白蛋白浓度的分析和比较完成所述鉴定。例如，当所述样品的测量的血清白蛋白浓度 值大于预先确定的截点值（例如，2. 8g/dL)时或当从所述个体得到的一种或多种免疫分析 物的浓度中的任一种大于或等于在健康个体血液中发现的相对应的免疫分析物的中值浓 度时（然而，对于IL-6,适用条件是个体血液中的浓度小于或等于健康个体血液中IL-6的 中值浓度），所述个体可以被鉴定具有从肝损伤存活的高可能性。相反地，当从所述个体得 到的血清白蛋白浓度小于或等于预先确定的截点值（例如，2. 8g/dL)时和当从所述个体 得到的一种或多种免疫分析物的浓度全部小于在健康个体血液中发现的相对应的免疫分 析物的中值浓度时（然而，对于IL-6,适用条件是个体血液中的浓度大于健康个体血液中 IL-6的中值浓度），所述个体可以被鉴定为具有死于肝损伤的高可能性。
[0020] 在另一方面中，本发明提供以接受肝移植的顺序对多名患者（包括第一名患者和 第二名患者）进行优先排序的方法。在这一点上，更迫切需要肝移植的患者可以相对于可 能完全不需要肝移植（或至少肝移植的需要不那么迫切）的患者优先排序。按照本发明 的某些实施方案，各自的血液样品是从多名患有（或相信患有）肝损伤的个体收到的。对 于每份样品，获得血清白蛋白的浓度值（例如，通过适当的测定测量），并且获得（例如，测 定）一种或多种免疫分析物各自的浓度值，所述免疫分析物选自由以下组成的组：TNF a， IL-12, IL-17, IL-4, IL-5, IL-13, IL-9, MIP-1 0，RANTES，FGF b，PDGF-bb 和 IL-6。
[0021 ]由第一名个体得到的免疫分析物浓度可以与在健康个体血液中发现的相对应的 免疫分析物的中值浓度进行比较，以确定所述个体的一种或多种免疫分析物的浓度中的 任一种是否小于在健康个体血液中发现的相对应的免疫分析物的中值浓度（然而，对于 IL-6,适用条件是所述个体血液中的浓度大于在健康个体血液中的IL-6的中值浓度）。类 似地，将从第二名个体得到的免疫分析物浓度与在健康个体血液中发现的相对应的免疫分 析物的中值浓度进行比较，以确定所述个体的一种或多种免疫分析物的浓度中的任一种是 否小于在健康个体血液中发现的相对应的免疫分析物的中值浓度（同样地，对于IL-6,适 用条件是所述个体血液中的浓度大于在健康个体血液中的IL-6的中值浓度）。
[0022] 在某些实施方案中，所述方法包括确定下述中的一个的步骤：（i)第一个体样品 具有大于预先确定范围或截点值（例如，2. 8g/dL)的血清白蛋白浓度值，或（ii)第一个体 样品的一种或多种免疫分析物的浓度中的任一种大于或等于健康个体血液中相对应的免 疫分析物的中值浓度（然而，对于IL-6,适用条件是所述个体血液中的浓度小于或等于在 健康个体血液中的IL-6的中值浓度）。在某些实施方案中，所述方法包括确定下述中的一 个的步骤：（i)第二个体样品具有小于预先确定范围（例如，2. 5-3. Og/dL)或小于或等于预 先确定的截点值（例如，2. 8g/dL)的血清白蛋白浓度值，（ii)第二个体样品的一种或多种 免疫分析物的浓度全部小于健康个体血液中相对应的免疫分析物的中值浓度（然而，对于 IL-6,适用条件是所述个体血液中的浓度大于在健康个体血液中的IL-6的中值浓度）。按 照本发明的某些实施方案，可以进行鉴定第二个体具有比第一个体更高的由肝损伤致死的 危险的步骤。因此，在某些实施方案中，可以进行另外的步骤，提供应该在对第一个体进行 肝移植之前对第二个体进行肝移植的推荐。在这一点上，第二个体优先第一个体排序接受 肝移植。
[0023] 在另一方面中，本发明提供可以用于实施本发明的方法的试剂盒。在某些实施 方案中，所述试剂盒可以包括：a)第一抗体，所述第一抗体适于检测并定量血清白蛋白和 /或选自由以下组成的组的免疫分析物：TNFa，IL-12, IL-17, IL-4, IL-5, IL-13, IL-9， MIP-1，RANTES，FGFb，H)GF-bb和IL-6 ; (ii)使用说明，所述使用说明关于基于免疫分析物 和血清白蛋白的浓度分别与代表具有健康肝脏的个体的相对应的免疫分析物的中值浓度 和预先确定的血清白蛋白的范围（例如，2. 5-3. Og/dL)或截点值（例如，2. 8gL)的比较来 表征肝损伤。在某些实施方案中，所述使用说明还包括列出具有健康肝脏的个体中的免疫 分析物（例如，TNFa，IL-12, IL-17, IL-4, IL-5, IL-13, IL-9, MIP-10，RANTES，FGF b， H)GF-bb，IL-6)的中值浓度的表格。
[0024] 在某些实施方案中，所述试剂盒还包括第二抗体，所述第二抗体适于检测血清白 蛋白和/或选自由以下组成的组的免疫分析物：TNFa，IL-12, IL-17, IL-4, IL-5, IL-13， IL-9，MIP-10，RANTES，FGF b，H)GF-bb和IL-6。在某些实施方案中，所述第二抗体与所述 第一抗体结合相同的免疫分析物，但是结合不同的表位。在其他实施方案中，所述第二抗体 与所述第一抗体结合不同的免疫分析物。
[0025] 在某些实施方案中，所述试剂盒还包括第二抗体和第三抗体，各自适合检测血清 白蛋白和/或选自由以下组成的组的免疫分析物：TNF a，IL-12, IL-17, IL-4, IL-5, IL-13， IL-9，MIP-10，RANTES，FGF b，H)GF-bb和IL-6。在某些实施方案中，第三抗体与所述第一 或第二抗体结合相同的免疫分析物，但是结合不同的表位。在其他实施方案中，所述第三抗 体与所述第一和第二抗体结合不同的免疫分析物。
[0026] 在某些实施方案中，所述试剂盒还包括第二抗体、第三抗体和第四抗体，各自适于 检测血清白蛋白和/或选自由以下组成的组的免疫分析物：TNFa，IL-12, IL-17, IL-4， 11-5，11-13，11-9，]\〇?-10，狀阶^5，？6?13，？〇6?-此和11-6。在某些实施方案中，所述第四 抗体与所述第一抗体、第二抗体或第三抗体结合相同的免疫分析物，但是结合不同的表位。 在其他实施方案中，所述第四抗体与所述第一、第二和第三抗体结合不同的免疫分析物。
[0027] 在某些实施方案中，所述试剂盒的第一抗体结合选自由IL-9, IL-17, RANTES和 roGF-bb组成的组的免疫分析物。在某些实施方案中，所述试剂盒的第一和第二抗体结合选 自由IL-9, IL-17, RANTES和roGF-bb组成的组的免疫分析物。在某些实施方案中，所述试 剂盒的第一、第二和第三抗体结合选自由IL-9, IL-17, RANTES和H)GF-bb组成的组的免疫 分析物。在某些实施方案中，所述试剂盒的第一、第二、第三和第四抗体结合选自由IL-9， IL-17, RANTES和PDGF-bb组成的组的免疫分析物。
[0028] 在某些实施方案中，至少一种抗体（例如，第一、第二、第三或第四抗体）连接在 固体支持物上。在某些实施方案中，所有这些抗体都连接在固体支持物上。所述固体支持 物可以提供多路测定，诸如将适用于检测和定量血清白蛋白和/或选自由以下组成的组的 免疫分析物（例如，三种或四种分析物）：TNFa，IL-12, IL-17, IL-4, IL-5, IL-13, IL-9， MIP-10，RANTES，FGF b，H)GF-bb和IL-6。在某些实施方案中，所述多路测定检测并定量 IL-9、IL-17、RANTES 和 PDGF-bb 中的每一种。
[0029] 附图简述
[0030] 已经在整体上这样描述了本发明的实施方案，现在将参考附图，所述附图没必要 按照比例，并且其中：
[0031] 图1示例本发明某些实施方案所述的方法；
[0032] 图2示例本发明某些实施方案所述的一种具体的方法；
[0033] 图3示例简化的免疫应答模型；
[0034] 图4显示示例具体研宄团体的流程图；
[0035] 图5示例DILI发作时血清中免疫分析物的分布；
[0036] 图6示例在6个月的随访时DILI受试者血清中的细胞因子的分布；
[0037] 图7示例在DILI发作时DILI受试者血清中趋化因子的分布。
[0038] 发明详述
[0039]现在将参考附图在下文中更充分地描述本发明，在所述附图中显示了本发明的一 些实施方案而不是全部的实施方案。事实上，本发明可以以多种不同的形式实施，并且不应 该解释为限于其中所述的实施方案；相反，提供这些实施方案，以使本公开内容满足适用的 法律要求。当在本说明书中和附上的权利要求书中时，单数形式"一个（'a'，'an'）"和 "所述（'the'）"包括复数对象，除非上下文明确另外指示。
[0040] 以其最概括的形式，本发明涉及表征个体中的肝损伤的方法。肝损伤的起源可以 是，例如，病毒性肝炎，缺血性肝炎，自体免疫性肝炎，DILI，或引起肝衰竭的代谢疾病。因 此，在某些实施方案中，肝损伤的起源是DILI。然而，在所述方法的一些应用中，肝损伤的 起源是未知的。肝损伤可以是威胁生命的肝损伤，或是不威胁生命的肝损伤。当用于本文 时，术语"威