配置各化合物标准曲线，外标 法定量。
[0099] 实验一、精密度实验及回收率实验
[0100] 在各类液相色谱与质谱联用的分析中，基质效应客观存在，并随样品的不同影响 作用不同。对常见的水产品鱼类、虾类、龟鳖类、蟹类基质下46种化合物的最低筛查限量值 进行了分析，取在所有样品基质中的能够筛查该化合物的最低值作为该化合物的筛查检出 限，筛查检出限的3倍值为定量浓度限。46种药物的提取离子流图见图1，线性范围、相关 系数、最低筛查限量值以及定量限见表2。
[0101] 表2、46种药物的基线性范围、最低筛查限量值、定量浓度限
[0102]
[0103]
[0104]
[0105] 为验证方法的适用性，分别对鱼类、虾类、龟鳖类、蟹类样品进行添加回收实验，添 加浓度分别为l〇、20、50yg/kg，每个样品、每个浓度重复测定6次，基质加标曲线定量。以 添加回收率计算方法准确度、相对标准偏差，结果见表3。
[0106] 表3、46种药物的回收率及相对标准偏差（η= 6)
[0107]
[0108]
[0109]
[oho] 实验二、筛查实际样品实验
[0111] 以筛查食品中是否含有恩诺沙星为例说明筛查过程。
[0112] 1)初筛：样品制备按上述实施例1步骤进行，再通过液相色谱-串联四级杆/飞 行时间质谱方法进行一级谱库筛查，根据检索结果，结合同位素峰的丰度比和质量差匹配 理论分子式组成以及其它特征离子信息与化合物在液相色谱上的保留时间实际判断。图2 为检索流程（检索后自动形成）。
[0113] 2)确证：欧盟2002/657/EC决议要求当使用高分辨质谱（飞行时间质谱属于高分 辨率质谱）作为确证技术时，化合物的确证需要至少4个鉴别分数。其中检测到1个结构 碎片获得2个鉴别分数，二级质谱中的每个子离子获得2. 5个分数，即1个具有精确质量数 的母离子和1个特征碎片子离子即可获得4. 5分的鉴定分数。在本试验条件下所有化合物 的结果均可达到这个要求。
[0114] 再通过46种药物的色谱保留时间，可以确证可疑化合物。图3为鱼肉样品中检出 的恩诺沙星，图3-1为恩诺沙星标准品碎片离子质谱图，图3-2为鱼肉样品中恩诺沙星的碎 片离子质谱图。图4为虾肉样品中检出疑似环丙沙星，虽然质谱图（图4-2)与环丙沙星标 准品的质谱图（图4-3) -致，但保留时间与环丙沙星标准品不一致（图4-1(下）），不能判 定为环丙沙星。
[0115] 对比例1、将实施例1中的"柱温"由40°C改成30°C，且，在"1)、制备待测样品溶 液"中，取消"过1. 2μm玻璃纤维滤膜（孔径1. 5μm) "，即，所得的稀释液直接后续步骤。 其余内容等同于实施例1。
[0116] 所得结果为：待测药物磺胺类药物、喹诺酮类药物、头孢类药物检测定量限（分别 为5~50μg/kg、5~10μg/kg、20~50μg/kg)均高于本发明的所涉及相同药物的定量 限，检测灵敏度不如本发明。此外，待测药物阿莫西林，头孢氨苄和头孢喹肟的整体加标回 收率（分别62. 5%、69· 7%、70· 9% )均不如本发明。
[0117] 最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发 明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容 直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1.适用于水产品中46种药物的筛查方法，其特征在于：46种药物为磺胺胍、磺胺吡啶、 磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺噻唑、恶喹酸、磺胺甲嘧啶、磺胺二甲异唑、磺胺甲二唑、磺胺二 甲基嘧啶、磺胺二甲基异嘧啶、磺胺对甲氧基嘧啶、磺胺间甲氧基嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺喹 恶啉、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺二甲基哒嗪、诺氟沙星、依诺沙星、环丙沙星、培氟沙星、洛美 沙星、丹诺沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、氟罗沙星、沙拉沙星、司帕沙星、奥比沙星、双氟沙星、 青霉素G、氨苄西林、阿莫西林、苯唑西林、萘夫西林、头孢氨苄、头孢匹林、头孢唑林、头孢 洛宁、头孢匹罗、头孢喹肟、红霉素、甲基睾丸酮、丙酸睾酮、群勃龙和诺龙；依次进行以下步 骤： (A) 样品提取：待测水产品经过提取液提取后静置，并用去离子水稀释后过玻璃纤维 滤膜，得稀释液； (B) 固相小柱萃取：利用固相萃取小柱对生物样品中所含的药物进行富集，固相萃取 小柱为OasisHLB小柱，使用前先用甲醇活化，超纯水淋洗，再将稀释液通过活化好的HLB 柱；富集过程中流速保持为4~6mL/min，整个过程保持小柱湿润； (C) 溶剂洗脱：利用有机试剂将目标药物从固相萃取柱上洗脱下来； (D) 浓缩与定容：对洗脱液进行浓缩，溶剂替换、定容，过膜后保存； (E) 上机筛查：通过液相色谱-串联四级杆/飞行时间质谱对样品进行筛查和鉴定，液 相色谱-串联四级杆/飞行时间质谱条件为： 高效液相色谱仪：HPLC-Agilentl290 ; 色谱柱：AgilentPlusC18 柱，尺寸为 3.OnmXlOOnm，1. 8μm; 柱温：40°C; 流速：〇· 25mL/min； 梯度洗脱流动相： A:加入甲酸的5mmol乙酸铵水溶液，甲酸的体积浓度为0. 1% ; B:加入甲酸的甲醇，甲酸的体积浓度为0. 1% ; 流动相梯度：质谱仪：AgilentQ-T0F6540 ; 离子源：DualAgilentJetStreamElectrosprayIonization(DualAJSESI)源； 电离模式：正离子模式； MS扫描范围：100-1000m/z; MS/MS碰撞电压固定3个强度通道（碰撞电压分别10eV，20eV，40eV); 进样量：2yL; 采用全扫描模式，调用已建立的质谱一级筛查谱库以分子式匹配模式自动检索，质量 允许误差设置5ppm; (F) 确证：对筛查发现的可疑化合物采用二级质谱信息库进一步确证； (G) 定量：对于经过确证的化合物，采用空白样品基质溶液配制标准曲线，外标法定 量。2. 根据权利要求1所述的适用于水产品中46种药物的筛查方法，其特征在于： 所述步骤（F)为： 通过一级筛查谱库对样品进行46种化合物筛查匹配，一级筛查谱库具体要素包括化 合物精确质量数，化合物质谱同位素峰丰度信息以及化合物的色谱保留时间，每个要素权 重相同，并以此筛查匹配得分；对匹配得分超过70分的筛查结果确认其为疑似化合物，采 用targetms/ms模式对其进行二级质谱信息采集，与建立的二级质谱信息库进行匹配确 证，如有两个二级特征碎片离子能够匹配成功的，即为确证。3. 根据权利要求1或2所述的适用于水产品中46种药物的筛查方法，其特征在于：所 述步骤（A)中的提取液是由乙腈和水按体积比3:2配置而成。4. 根据权利要求1或2所述的适用于水产品中46种药物的筛查方法，其特征在于：所 述步骤（C)中的有机溶剂是体积比为1:1的乙腈和甲醇的混合溶剂。5. 根据权利要求1或2所述的适用于水产品中46种药物的筛查方法，其特征在于：所 述步骤（D)中对洗脱液进行浓缩是用队缓缓吹扫溶剂至近干；所述溶剂替换是用乙腈进行 复溶；所述的定容是用体积浓度1 %甲酸水溶液定容。
【专利摘要】本发明公开了一种适用于水产品中46种药物的筛查方法，包括以下步骤：样品提取；利用固相萃取小柱对生物样品中所含的药物进行富集；利用有机试剂将目标药物从固相萃取柱上洗脱下来；对洗脱液进行浓缩，溶剂替换、定容，过膜后保存；通过液相色谱-串联四级杆/飞行时间质谱对样品进行筛查和鉴定；对筛查发现的可疑化合物采用二级质谱信息库进一步确证；对于经过确证的化合物，采用空白样品基质溶液配制标准曲线，外标法定量。采用本发明的方法能快速、准确地定性定量测定水产品中的46种药物。
【IPC分类】G01N30/88
【公开号】CN105388245
【申请号】CN201510995165
【发明人】李诗言, 王扬, 张海琪, 周凡, 何中央, 郑重莺, 柯庆青, 王鼎南, 贝亦江
【申请人】浙江省水产技术推广总站
【公开日】2016年3月9日
【申请日】2015年12月25日