用于保护免于白喉和/或破伤风的缀合物的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请要求美国临时申请61/738, 958 (2012年12月18日提交）的权益，其完整 内容出于所有目的由此通过引用并入本文。
技术领域
[0002] 本发明是在免疫领域中，特别是使用缀合物疫苗。
【背景技术】
[0003] 在单一剂量中含有来自多于一种病原生物体的抗原的疫苗被称为"组合"疫苗。已 经证明各种组合疫苗(包括用于保护免于白喉、破伤风和百日咳的早期三价疫苗（"DTP"疫 苗））。当前可用的最复杂的多病原体疫苗是6价的，并且包括白喉、破伤风、百日咳、脊髓灰 质炎、乙型肝炎和Hib的抗原（D-T-aP-IPV-HBV-Hib)。这些疫苗已经是非常复杂的，并且获 得具有进一步抗原的疫苗的批准不是简单的。
[0004] 6价疫苗包括缀合至破伤风类毒素载体蛋白的Hib糖。针对其他病原体的已知缀 合物疫苗包括分别针对脑膜炎球菌和肺炎球菌的MENVEO ?和PREVNAR ?产品。接受缀合物 疫苗后，已知不仅针对糖、而且针对载体蛋白产生抗体。典型的载体蛋白包括白喉和破伤风 类毒素。这些本身是保护性抗原，但参考文献1报道，这些类毒素的缀合物"不足以诱导关 于载体的完全免疫"。为什么缀合去除类毒素的保护效力的可能解释可以是糖的共价偶联 破坏或掩盖保护性表位（线性或构象的），或者缀合降低载体蛋白的柔性。
[0005] 尽管缀合引起保护效力的这种总体损失，但参考文献1报道，破伤风或白喉类毒 素甚至在肺炎链球菌糖的缀合之后可以保留其保护作用。作者没有将该发现外推至任何 其他糖类，但的确预期，可以用CRM197看到相同结果（参见参考文献1中的[0041])，所述 CRM197是白喉毒素的无毒突变体。CRM197是疫苗糖缀合物中的另一种众所周知的载体蛋 白，并且它与白喉毒素的不同在于单个氨基酸突变。
[0006] 参考文献2报道了使用破伤风类毒素的4价脑膜炎球菌缀合物疫苗（现批准为 NMENRIX?产品）的研究。作者报道，100%的疫苗受体产生抗破伤风抗体，但这些患者已经 接受包括破伤风类毒素的常规儿科疫苗，并且在接受4价脑膜炎球菌疫苗之前具有抗破伤 风抗体的患者的比率已经大于90%。因此，参考文献2没有给出任何关于缀合物疫苗是否 可以在未引发的幼稚的婴儿（un-primed naive infants)中诱导显著的抗破伤风免疫应答 的信息。此外，参考文献2使用无法揭示那些抗体是否具有保护作用的ELISA测试检测抗 破伤风抗体。用于测量此类抗体的其他测试（例如，用于测定MENACTRA?产品引发的抗白 喉抗体的中和作用的CHO中和测定）也没有揭示抗体是否在体内具有保护作用。
[0007] 也已经以这种方式研究CRM197。参考文献3显示CRM197在人中是免疫原性的， 但，再次，在先前已经接受白喉类毒素疫苗，而不是在幼稚的（naive)患者中，测量到免疫 应答，并且所述免疫应答通过体外测定（ELISA)、而不是功能测定测定到。
[0008] 尽管白喉和破伤风类毒素在缀合至细菌糖类后保留至少一些免疫原性，但因此不 清楚它们是否保留它们的保护效力。因此，疫苗诸如NMENRIX ?或MENACTRA ?是否可以在 免疫幼稚受试者中引发保护性抗破伤风或抗白喉免疫是未知的。类似地，缀合的CRM197，如 MENVEO ?和PREVNAR ?产品中所使用，是否可以在这些受试者中引发保护性抗白喉免疫是不 清楚的。
[0009] 发明概述 本发明人已经显示使用白喉类毒素或破伤风类毒素作为载体蛋白（诸如MenactratMp menitorix?产品）、但不含有类毒素作为单独抗原的现有糖缀合物疫苗可以赋予针对白喉 毒素或破伤风毒素的致死攻击的保护。因此，除了保护免受其糖类已经连接至载体的细菌 影响以外，此类缀合物疫苗也可以用于保护免于白喉和破伤风。这意味着，当前复杂组合疫 苗的白喉和破伤风类毒素组分可以是多余的。因此，可以降低这些疫苗的抗原复杂性，而不 降低其保护宽度。此外，去除这些多余组分在疫苗中产生空间用于添加免疫原用于保护免 受进一步病原体的影响。例如，现有的六价疫苗D-T-P-HBV-IPV-Hib可以（a)通过去除未 缀合的T组分和依赖于Hib缀合物中的T载体而简化，（b)通过用具有T载体的MenC缀合 物替代未缀合的T组分而扩展，而不增加抗原复杂性，和/或（c)通过用MenACWY-D缀合物 替代未缀合的D组分和在Hib缀合物中的T载体代替未缀合的T而大大扩展，而不相应增 加抗原复杂性。
[0010] 因此，本发明的第一个方面提供了用于针对多种病原体免疫婴儿的方法，其包括 用（a)含有未缀合的白喉类毒素、但不含有未缀合的破伤风类毒素的疫苗；和（b)含有缀合 至破伤风类毒素载体的糖的疫苗共同免疫婴儿的步骤。
[0011] 本发明的第二个方面提供了用于针对多种病原体免疫婴儿的方法，其包括用（a) 含有未缀合的破伤风类毒素、但不含有未缀合的白喉类毒素的疫苗；和（b)含有缀合至白 喉类毒素载体的糖的疫苗共同免疫婴儿的步骤。
[0012] 本发明的第三个方面提供了用于针对多种病原体免疫婴儿的方法，其包括用（a) 不含未缀合的破伤风类毒素且不含未缀合的白喉类毒素的疫苗；(b)含有缀合至白喉类毒 素载体的糖的疫苗；和（c)含有缀合至白喉类毒素载体的糖的疫苗共同免疫婴儿的步骤。
[0013] 本发明的第四个方面提供了包含未缀合的白喉类毒素和缀合至破伤风类毒素载 体的糖、但不含未缀合的破伤风类毒素的组合疫苗。
[0014] 本发明的第五个方面提供了包含未缀合的破伤风类毒素和缀合至白喉类毒素载 体的糖、但不含未缀合的白喉类毒素的组合疫苗。
[0015] 本发明的第六个方面提供了包含缀合至破伤风类毒素载体的糖和缀合至白喉类 毒素载体的糖、但不含未缀合的破伤风类毒素且不含未缀合的白喉类毒素的组合疫苗。
[0016] 本发明的第七个方面提供了包含至少两种试剂盒组分的试剂盒，所述试剂盒组 分，当混合时，导致第三至第六个方面的组合疫苗。
[0017] 本发明的第八个方面提供了用于针对脑膜炎球菌疾病和破伤风免疫婴儿的方法， 其包括施用含有缀合至破伤风类毒素载体的脑膜炎球菌荚膜糖的疫苗而不施用未缀合的 破伤风类毒素的步骤。
[0018] 本发明的第九个方面提供了用于针对脑膜炎球菌疾病和白喉免疫婴儿的方法，其 包括施用含有缀合至白喉类毒素载体的脑膜炎球菌荚膜糖的疫苗而不施用未缀合的白喉 类毒素的步骤。
[0019] 尽管白喉和破伤风缀合物可以赋予针对白喉毒素或破伤风毒素的致死攻击的保 护，但本发明人已经显示，用CRM197载体（其与白喉毒素的不同在于单个氨基酸突变）没 有看到相同的效果。因此，基于CRM197的缀合物不能以上面讨论的方式使用，但本发明人 的发现具有不同的影响。由于在缀合物疫苗的背景下CRM197是比Dt更弱的白喉免疫原， 所以当缀合物疫苗与当前婴儿组合疫苗（其含有Dt和Tt)同时给予时，它作为载体是更有 吸引力的，因为对于载体蛋白诱导的负面干扰，它们可以提供更低的潜能。因此，本发明的 第十个方面提供了用于针对多种病原体免疫婴儿的方法，其包括用（a)含有白喉类毒素和 破伤风类毒素的疫苗；和（bl)含有缀合至CRM197载体的脑膜炎球菌荚膜糖的疫苗；(b2) 含有缀合至CRM197载体的肺炎球菌荚膜糖的疫苗；(b3)含有缀合至CRM197载体的脑膜炎 球菌荚膜糖的第一疫苗和含有缀合至CRM197载体的肺炎球菌荚膜糖的第二疫苗；或（b4) 含有各自缀合至CRM197载体的肺炎球菌和脑膜炎球菌荚膜糖的疫苗中的一种共同免疫婴 儿的步骤。
[0020] 婴儿 本发明用于免疫婴儿，即从出生直至12个月龄，例如0-9个月或0-6个月的人。因此， 例如，婴儿可以是2个月龄、3个月龄、4个月龄、5个月龄或6个月龄。
[0021] 本发明联合婴儿的针对白喉和破伤风的初次免疫（这通常发生在2个月龄）是特 别有用的。因此，婴儿在免疫时对于破伤风类毒素（Tt)和/或白喉类毒素（Dt)是理想地 免疫上幼稚的（immunologically naive)。
[0022] 共同免疫 当本发明是指共同免疫时，枚举列表中的不同疫苗可以单独或作为组合施用。
[0023] 其中单独施用疫苗时，它们通常将在不同部位施用，例如一次疫苗施用于左上臂， 且第二次疫苗施用于右上臂。因此，两次疫苗可以对侧（例如双臂或双腿或对侧臂和腿） 或同侧（例如身体的同侧的臂和腿）施用。虽然分开施用疫苗，但它们在基本上同时（例 如，相同的医疗咨询或访问健康护理专业人员或接种中心过程中），诸如在彼此的1小时内 施用。
[0024] 不是分开共同免疫，然而，优选作为组合施用。因此，优选的共同免疫使用组合疫 苗，即，其中混合不同的免疫原的单一组合物。组合疫苗为患者提供接受减少注射次数的优 点，从而可以导致顺应性提高（例如参见参考文献4的第29章）的临床优点，特别是在儿 科患者中。在本发明的第一个方面，例如，婴儿优选接受单一组合物，其包括未缀合的Dt和 缀合至Tt载体的糖。
[0025] 缀合和未缀合的类毒素载体 当类毒素是缀合的类毒素时，其共价连接（直接或经由接头）至另一部分，其通常将是 糖抗原（例如，细菌荚膜糖）。
[0026] 本发明的第一至第九个方面是指包括或施用（或不包括/施用）"未缀合的"Dt 和/或Tt的疫苗。该术语意指类毒素没有缀合至另一个抗原，例如缀合至糖抗原。因此，例 如，"未缀合的"Tt将排除缀合的PRP-T或N頂ENRIX ?产品中存在的Tt，并且"未缀合的"Dt 将排除缀合的PRP-D或MENACTRA ?产品中存在的Dt。
[0027] 当疫苗被定义为含有特定未缀合的类毒素时，它也可以（除非明确指明）包括缀 合形式的相同类毒素，例如包括未缀合的Tt的疫苗可以包括Tt和PRP-T两者。相反，当疫 苗被定义为不含（或被定义为不含有）特定未缀合的类毒素时，它可以（并且通常将）包 括缀合形式的类毒素，例如不含未缀合的Tt的疫苗可以仍然包括Hib-τ。
[0028] 关于类毒素的术语"未缀合的"不是指用于制备缀合物、但无论什么原因已经保持 作为未反应的残余类毒素或已经变得去缀合的类毒素。因此，例如，是涉及类毒素的缀合反 应，并且糖是不完全的，然后可以保留小残余量的未反应的类毒素（甚至纯化之后），并且 如果缀合物然后与其他组分混合，这将被完成为组合物。类似地，如果缀合物被储存长时间 段或储存在恶劣条件下，可以发生分解，使得发生去缀合。当组合物据称不含未缀合的类毒 素时，它仍然可以包括缀合后残余类毒素或去缀合类毒素（如果这存在于当制备组合物时 使用的缀合的类毒素组分中）。技术人员可以认识到有目的存在的未缀合的类毒素和相反 作为残余污染物或作为分解产物存在的类毒素之间的差异，当组合物确实不含未缀合的毒 素时，这将是容易理解的。例如，本发明涉及人疫苗，其是通过良好定义的方法制备的紧密 调节的产品，并且制备含有缀合的类毒素、但不含未缀合形式的该类毒素的组合物的技术 人员将不使用其中该类毒素从未经受缀合反应的组分；相反，制备含有未缀合的类毒素的 组合物的技术人员将不使用先前经历缀合反应的类毒素。因此，当疫苗被定义为不含有未 缀合的类毒素时，该类毒素的任何缀合后残余形式或去缀合形式将占疫苗中该类毒素的总 量的〈10重量％(例如，〈5%、〈2%或〈1%)。
[0029] 当疫苗意欲保护免于破伤风时，它将包括足够的免疫原性破伤风类毒素以满足欧 洲药典对于破伤风接种的要求（保护小鼠免于破伤风毒素的致死攻击）。类似地，当疫苗意 欲保护免于白喉时，它将包括足够的免疫原性白喉类毒素以满足欧洲药典对于白喉接种的 要求（保护豚鼠免于白喉毒素的致死攻击）。
[0030] 具有未缀合的白喉类毒素、但没有未缀合的破伤风类毒素的疫苗 本发明的第一个方面用（a)含有未缀合的Dt、但不含有未缀合的Tt的疫苗；和（b)含 有缀合至Tt载体的糖的疫苗共同免疫。当用（a)和（b)的共同免疫作为组合疫苗发生时， 这得到本发明的第四个方面。
[0031] 因此，这些疫苗不使用未缀合的Tt制备，并且为了保护免于破伤风，它们反而 包括缀合至Tt载体的糖。此类与Tt载体缀合的糖包括但不限于：脑膜炎球菌糖，诸如 NEISVAC-C ?、MENHIBRIX ?、MENITORIX ?或N頂ENRIX ?产品中任一种中存在的缀合物；肺 炎球菌糖，诸如SYNFL0RIX?产品中存在的血清型18C缀合物；流感嗜血杆菌B型糖，诸如 HIBTITER ?、MENHIBRIX ?、MENITORIX ?或 HIBERIX ?产品中任一种中存在的缀合物。
[0032] 因此，本发明可以使用以下糖类中的一种或多种，其缀合至Tt载体：脑膜炎球菌 血清群A荚膜糖；脑膜炎球菌血清群C荚膜糖；脑膜炎球菌血清群Wl35荚膜糖；脑膜炎球 菌血清群X荚膜糖；脑膜炎球菌血清群Y荚膜糖；肺炎球菌血清型18C荚膜糖；肠道沙门氏 菌eflterica)血清变型Typhi (51 Typhi)毒力荚膜多糖（'Vi'）；和/或流 感嗜血杆菌B型荚膜糖。
[0033] 此外，疫苗可包括进一步的糖，其缀合至非Tt载体，例如SYNFLORIX?产品中存在 的其他10种缀合物中的任一种。如果疫苗不包括来自脑膜炎球菌血清群A、C、W135和Y 的Tt-缀合的荚膜糖，它可包括这些作为如MENVE0?产品中的CRM197-缀合的糖类，或作为 如MENACTRA ?产品中的Dt-缀合的糖类。如果疫苗不包括来自肺炎球菌的Tt-缀合的荚 膜糖类，它可包括这些作为来自PREVNAR ?或PREVNAR13 ?产品中的CRM197-缀合的糖类。 如果疫苗不包括来自5： Typhi的Tt-缀合的Vi荚膜糖类，它可包括这作为Dt-缀合的或 CRM197-缀合的糖[5，6]。
[0034] 可用于在本发明的第一个方面内共同免疫婴儿和本发明的第四个方面的组合疫 苗的疫苗（a)和（b)的具体实例包括但不限于：
[0035] 第四个方面的六种特别优选的组合疫苗是：（a) Dt、aP、HBsAg、IPV、Hib-Tt ; (b) Dt、aP、HBsAg、IPV、Hib-Tt、MenC-Tt ; (c) Dt、aP、HBsAg、IPV、Hib-Tt、MenC-CRM197 ; (d) Dt、aP、HBsAg、IPV、Hib-Tt、MenACWY-CRM197 ;(e) Dt、aP、HBsAg、IPV、Hib-Tt、MenACWY-Dt ; (f) Dt、aP、HBsAg、IPV、Hib-Tt、MenACWY-Tt ; (g) Dt、aP、HBsAg、IPV、Hib-Tt、MenX-Tt ;和 (h) Dt、aP、HBsAg、IPV、Hib-Tt、MenX-CRM197〇
[0036] 本发明的第八个方面提供了用于针对脑膜炎球菌疾病和破伤风免疫婴儿的方法， 其包括施用含有缀合至破伤风类毒素载体的脑膜炎球菌荚膜糖的疫苗而不施用未缀合形 式的破伤风类毒素的步骤。因此，所述缀合物用于针对脑膜炎球菌和破伤风两者的免疫，而 无需分别需要类毒素作为未缀合的免疫原。除了缀合物以外，与第八个方面使用的疫苗可 包括如此处详述的进一步抗原用于本发明的第一个方面。因此，疫苗可以保护免于不仅仅 脑膜炎球菌和破伤风。
[0037] 具有未缀合的破伤风类毒素、但没有未缀合的白喉类毒素的疫苗 本发明的第二个方面用（a)含有未缀合的Tt、但不含有未缀合的Dt的疫苗；和（b)含 有缀合至Dt载体的糖的疫苗共同免疫。当用（a)和（b)的共同免疫作为组合疫苗发生时， 这得到本发明的第五个方面。
[0038] 因此，这些疫苗不使用未缀合的Dt制备，并且为了保护免于白喉，它们反而包 括缀合至Dt载体的糖。此类与Dt载体缀合的糖包括但不限于：脑膜炎球菌糖，诸如 MENACTRA?产品中存在的缀合物；肺炎球菌糖，诸如SYNFLORIX?产品中存在的血清型19F 缀合物；流感嗜血杆菌B型糖，诸如PROHIBIT ?产品中存在的