脂酰肌醇，这在天然HBV病毒体中不存在。该颗粒还 可包括无毒量的LPS，以便刺激免疫系统[49]。所述颗粒可以保留非离子表面活性剂（例 如聚山梨醇酯20)，如果这是在酵母的破坏过程中使用[50]。
[0159] 在细胞破坏后，HBsAg纯化的优选方法涉及：超滤；大小排阻层析；阴离子交换层 析；超速离心；脱盐；和过滤除菌。细胞破坏（例如，使用聚乙二醇）后，可沉淀裂解物，将 HBsAg留在溶液中，准备进行超滤。
[0160] 纯化后，HBsAg可经受透析（例如用半胱氨酸），其可用于去除可能在HBsAg制备 过程中已经使用的任何汞防腐剂诸如硫柳汞[51]。优选不含硫柳汞的制剂。
[0161] HBsAg 优选来自 HBV 亚型 adw2。
[0162] HBsAg的量通常以微克表示。如果本发明的疫苗包括HBsAg，则每单位剂量的正常 量是 5-25Pg，例如 IOPg 或 2〇Pg。
[0163] 如果组合物包括铝盐佐剂，则HBsAg可吸附至其上（优选吸附至磷酸铝佐剂上）。
[0164] Hib缀合物 流感嗜血杆菌b型（'Hib'）引起细菌性脑膜炎。Hib疫苗通常基于'PRP'荚膜糖抗 原（例如，参考文献4的第14章），其制备是充分记载的（例如参考文献52-61)。将Hib糖 缀合至载体蛋白以增强其免疫原性，特别是在儿童中。典型的载体蛋白是破伤风类毒素、白 喉类毒素、白喉类毒素的CRM197衍生物、或来自血清群B脑膜炎球菌的外膜蛋白复合物。 破伤风类毒素是有用的载体，如通常被称为'PRP-T'或'Hib-T'的产品中所使用，即共价结 合至破伤风蛋白的纯化的Hib磷酸多核糖基核糖醇荚膜多糖。PRP-T可通过以下制备：使 用溴化氰活化Hib荚膜多糖，将活化的糖偶联至己二酸接头（诸如（1-乙基-3-(3-二甲基 氨基丙基）碳二亚胺），通常为盐酸盐），然后使接头-糖实体与破伤风类毒素载体蛋白反 应。CRM197是用于本发明的组合物中的Hib缀合物的另一种有用的载体（例如，如'HbOC' 和'Vaxem-Hib'产品中所见）。
[0165] 缀合物的糖部分可包含从Hib细菌制备的全长磷酸多核糖基核糖醇（PRP)，和/或 全长PRP的片段。可使用具有1 : 5(即过量蛋白）至5 : 1(即过量糖）的糖：蛋白比率 (w/w)的缀合物，例如，比例在1 : 2至5 : 1的比率和1 : 1.25至1 : 2. 5的比率。然 而，在优选的疫苗中，糖与载体蛋白的重量比为1 : 2.5至1 : 3.5。在破伤风类毒素作为 抗原和作为载体蛋白两者存在的疫苗中，缀合物中糖与载体蛋白的重量比可为1 : 0.3至 I : 2[62]。Hib缀合物的施用优选导致20. 15Pg/ml、且更优选2lKg/ml的抗PRP抗体浓度， 并且这些是标准响应阈值。
[0166] Hib抗原的量通常以糖的微克数表示。如果本发明的组合物包括Hib抗原，则每单 位剂量的正常量是5_15Pg，例如IOPg或12Pg。
[0167] 如上所述，缀合物中的荚膜糖与载体蛋白的比率可以变化，使得所述缀合物可以 提供足够的类毒素以满足对于保护的最低功效要求，和足够的糖以提供所需剂量。该比率 将根据类毒素的特定功效而变化。因此，Hib缀合物中的糖：类毒素质量比可以变化，具有 过量糖（以质量计），等量的两者（例如，IOKg Hib糖缀合至IOPg类毒素），或者过量载体 (以质量计）。过量载体蛋白是典型的。
[0168] 如果疫苗包括铝盐佐剂，则Hib抗原可吸附至其上，或可以是未吸附的。
[0169] 脑膜炎球菌荚膜糖缀合物 当组合物包括脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖缀合物时，可以存在一种或多于一种此类缀 合物。包括血清群A、C、W135和Y中的2种、3种或4种是典型的，例如A+C、A+W135、A+Y、 C+W135、C+Y、W135+Y、A+C+W135、A+C+Y、A+W135+Y、A+C+W135+Y 等。包括来自所有四种血清 群A、C、W135和Y的糖的组分是有用的，如在MENVEO ?、MENACTRA ?和N頂ENRIX ?产品中。 也可能包括血清群X脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖的缀合物。
[0170] 当包括来自多于一种血清群的缀合物时，这些优选分开制备、分开缀合、然后组 合。它们可以以基本上相等的质量存在，例如每种血清群的糖的质量在彼此的土 10%之内。 每种血清群的典型量为IKg至2〇μ8,例如每种血清群2至10 μ8,或约4μ8或约5 μ g或约 10 μ g。作为基本上相等比率的替代方案，可以使用双倍质量的血清群A糖（如在MENVE0? 产品中）。
[0171] 缀合物的施用优选导致针对相关血清群的血清杀菌测定（SBA)滴度增加至少4 倍，优选至少8倍。SBA滴度可使用幼兔补体或人补体测量[63]。
[0172] 血清群A脑膜炎球菌的荚膜糖（'MenA'）是（a 1 - 6)-连接的A乙酰基-D-甘 露糖胺-1-磷酸酯（其在C3和C4位置具有部分0-乙酰化）的均聚物。C-3位置的乙酰 化可以是70-95%。用于纯化糖的条件可导致去-0-乙酰化（例如在碱性条件下），但保留 该C-3位置的OAc是有用的。在一些实施方案中，血清群A糖中的至少50% (例如，至少 60 %、70 %、80 %、90 %、95 %或更多）甘露糖胺残基在C-3位置被0-乙酰化。乙酰基可以用 封闭基团取代，以防止水解[64]，并且此类修饰的糖仍然是本发明的含义内的血清群A糖。
[0173] 血清群C ( 'MenC'）荚膜糖是（α 2 -9)-连接的唾液酸乙酰基神经氨酸， 或'NeuNAc'）的均聚物。该糖结构被写作一9)-Neu NAc 7/8 OAc-(α 2-。大多数血 清群C菌株在唾液酸残基的C-7和/或C-8具有0-乙酰基，但约15 %的临床分离株缺乏 这些0-乙酰基[65，66]。OAc基团的存在或不存在生成独特表位，且抗体结合糖的特异性 可影响其针对〇-乙酰化（OAc-)和去-0-乙酰化（OAc+)菌株的杀菌活性[67-69]。用于 本发明的血清群C糖类可从OAc+或OAc-菌株制备。批准的MenC缀合物疫苗包括OAc -(NEISVAC-Ctm)和 OAc+ (MENJUGATE? & MENINGITEC?)糖类两者。在一些实施方案中，用 于产生血清群C缀合物的菌株是OAc+菌株，例如血清型16的菌株，血清亚型PL 7a，1等。 因此，可以使用C:16:P1. 7a，I OAc+菌株。血清亚型PL 1的OAc+菌株也是有用的，诸如 Cll菌株。优选的MenC糖取自OAc+菌株，诸如菌株Cll。
[0174] 血清群W135( 'MenW'）荚膜糖是唾液酸-半乳糖二糖单元的聚合物。如血清群C 糖，它具有不同的0-乙酰化，但在7和9位置的唾液酸[70]。其结构可写作：一4) -D-Neup 5Ac (7/90Ac) - α - (2 - 6) -D-Gal- a - (1 -。
[0175] 血清群X ( 'MenX'）荚膜糖是α I - 4-连接的N-乙酰基葡糖胺1-磷酸酯的聚 合物。血清群X结构被写作：一4) - a -D-GIc/jNAc- (1 - 0P03-。
[0176] 血清群Y( 'MenY'）糖类似于血清群W135糖，除了二糖重复单元包含葡萄糖而非 半乳糖。如血清群W135,它在7和9位置的唾液酸具有不同的0-乙酰化[70]。血清群Y 结构可写作：一4)-D-Neu/?5Ac(7/90Ac)-a - (2 - 6)-D-Glc_a - (1 -。
[0177] 根据本发明使用的糖可以如上所述被0-乙酰化（例如，具有与天然荚膜糖中所见 相同的0-乙酰化模式），或者它们可以在糖环的一个或多个位置被部分或完全去-〇-乙酰 化，或者它们可以相对于天然荚膜糖被高（hyp er)-〇-乙酰化。例如，参考文献71报道了使 用超过80%被去-0-乙酰化的血清群Y糖。
[0178] 脑膜炎球菌缀合物中的糖部分可包含制备自脑膜炎球菌的全长糖类，和/或可包 含全长糖类的片段，即糖类可短于在细菌中发现的天然荚膜糖。因此，将糖类解聚，其中解 聚在糖纯化过程中或之后、但在缀合之前发生。解聚降低了糖类的链长。一种解聚方法涉及 使用过氧化氢[72]。将过氧化氢添加至糖（例如得到1 %的最终H2O2浓度），然后孵育（例 如在约55°C )混合物，直到已经实现期望的链长降低。另一种解聚方法涉及酸水解[73]， 并且其他方法包括微流化或超声处理[74]。其他解聚方法是本领域已知的。用来制备用 于本发明的缀合物的糖类可通过这些解聚方法中的任一种获得。可以使用解聚来提供免 疫原性的最佳链长和/或针对糖类的物理可操作性降低链长。在一些实施方案中，糖类具 有以下范围的平均聚合度（Dp) :A=10-20;C=12-22;W135=15-25;Y=15-25。对于所有血清 群，在分子量而非 Dp 方面，有用范围为：〈100kDa ;5kDa-75kDa ;7kDa-50kDa ;8kDa-35kDa ; 12kDa-25kDa;15kDa-22kDa。在其他实施方案中，来自脑膜炎球菌血清群A、C、W135和Y 中每种的糖的平均分子量可以是大于50kDa，例如275kDa、21〇〇kDa、211〇kDa、2120kDa、 2130kDa等[74]，甚至至多达1500kDa，特别是通过MALLS测定。例如：MenA糖的范围可以 是50-500kDa，例如60-80kDa ;MenC糖的范围可以是100-210kDa ;MenW135糖的范围可以是 60-190kDa，例如 120-140kDa ;和 / 或 MenY 糖的范围可以是 60-190kDa，例如 150-160kDa。
[0179] 如果组分或组合物包括Hib和脑膜炎球菌缀合物两者，则在一些实施方案中，Hib 糖的质量可以与特定脑膜炎球菌血清群糖的质量基本上相同。在一些实施方案中，Hib糖的 质量将大于（例如，至少1.5x)特定脑膜炎球菌血清群糖的质量。在一些实施方案中，Hib 糖的质量将小于（例如，小至少1.5x)特定脑膜炎球菌血清群糖的质量。
[0180] 当组合物包括来自多于一种脑膜炎球菌血清群的糖，存在每种血清群的平均糖质 量。如果使用每种血清群的基本上相等的质量，则平均质量与每种单独质量将是相同的；当 使用不相等质量，则平均值将是不同的，例如，对于MenACWY混合物具有10:5:5:5 μ g量， 平均质量是6. 25 μ g/血清群。在一些实施方案中，Hib糖的质量将与脑膜炎球菌糖的平均 质量/血清群是基本上相同的。在一些实施方案中，Hib糖的质量将大于（例如，至少I. 5x) 脑膜炎球菌糖的平均质量/血清群。在一些实施方案中，Hib糖的质量将小于（例如，至少 I. 5x)脑膜炎球菌糖的平均质量/血清群[75]。
[0181] 如上所述，缀合物中的荚膜糖与载体蛋白的比率可以变化，使得所述缀合物可以 提供足够的类毒素以满足对于保护的最低功效要求，和足够的糖以提供所需剂量。该比率 将根据类毒素的特定功效而变化。因此，脑膜炎球菌缀合物中的糖：类毒素质量比可以变 化，具有过量糖（以质量计），等量的两者（例如，1〇呢脑膜炎球菌糖缀合至1〇呢类毒素）， 或者过量载体（以质量计）。过量载体蛋白是典型的。例如，MENACTRA?产品具有16 μ g糖 (4 μ g/血清群）和48 μ g白喉类毒素，而NMENRIXtm产品具有20 μ g糖（5 μ g/血清群）和 44 μ g破伤风类毒素。
[0182] 当疫苗组合物包括来自多于一种血清群的荚膜糖时，优选的是，每种单独缀合物 使用相同的载体蛋白。因此，用于脑膜炎球菌糖的载体蛋白可以是CRM197 (如MENVEO ?产 品中），Dt (如MENACTRA ?产品中），或Tt (如在NMENRIX ?产品中）。然而，在一些实施方 案中，不同的血清群可以使用不同的载体，例如缀合至CRM197的至少一种血清群，且缀合 至Tt的至少一种血清群。
[0183] 肺炎球菌荚膜糖缀合物 肺炎链球菌引起细菌性脑膜炎，并且现有的疫苗基于荚膜糖类。因此，本发明的疫苗组 合物可包括至少一种缀合至载体蛋白的肺炎球菌荚膜糖。
[0184] 本发明可包括来自一种或多种不同肺炎球菌血清型的荚膜糖。当组合物包括来自 多于一种血清型的糖抗原时，这些优选地单独制备，单独缀合，然后组合。用于纯化肺炎球 菌荚膜多糖的方法是本领域已知的（例如参见参考文献76)，并且多年已知基于来自23种 不同血清型的纯化糖的疫苗。已经描述了这些方法的改进，例如，对于血清型3,如参考文献 77中所述，或者对于血清型1、4、5、6六、68、7?和19六，如参考文献78中所述。
[0185] 肺炎球菌荚膜糖将通常选自以下血清型：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、 11八、12?、14、158、17?、18(：、19厶、19?、20、22?、23?和/或33?。因此，总共，组合物可以包括 来自 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23 或更多种不同 的血清型的荚膜糖。包括至少血清型6B糖的组合物是有用的。
[0186] 有用的血清型组合是7价组合，例如包括来自4、6B、9V、14、18C、19F和23F各血 清型的荚膜糖。另一种有用组合是9价组合，例如包括来自1、4、5、68、利、14、18(：、19?和 23F各血清型的荚膜糖。另一种有用组合是10价组合，例如包括来自1、4、5、6B、7F、9V、 14、18C、19F和23F各血清型的荚膜糖。11价组合可进一步包括来自血清型3的糖。可以 将12价组合添加至10价混合物：血清型6A和19A ;6A和22F ;19A和22F ;6A和15B ;19A 和15B ;或22F和15B。可以将13价组合添加至11价混合物：血清型19A和22F ;8和12F ; 8 和 15B ;8 和 19A ;8 和 22F ;12F 和 15B ;12F 和 19A ;12F 和 22F ;15B 和 19A ;15B 和 22F ;6A 和19A等。
[0187] 因此，有用的13价组合包括来自血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19 (或 19A)、19F和23F的荚膜糖，例如如参考文献79-82中所公开制备。一种此类组合包括约 8 μ g/ml的血清型6B糖和浓度各约4 μ g/ml的其他12种糖。另一种此类组合包括各约 8 μ g/ml的血清型6A和6B糖和各约4 μ g/ml的其他11种糖。
[0188] 用于肺炎球菌缀合物疫苗的特别有用的载体蛋白是CRM197、破伤风类毒素、白喉 类毒素和流感嗜血杆菌蛋白D。CRM197用于PREVNAR?中。13价混合物可使用CRM197作 为13种缀合物中每种的载体蛋白，并且CRM197可以约55-60 μ g/ml存在。
[0189] 当组合物包括来自多于1种肺炎球菌血清型的缀合物时，对于各单独缀合物可使 用相同的载体蛋白或使用不同的载体蛋白。尽管在两种情况下，不同缀合物的混合物将通 常通过单独制备各血清型缀合物，然后将其混合以形成单独缀合物的混合物而形成。参 考文献83描述了当在多价肺炎球菌缀合物疫苗中使用不同载体蛋白时的潜在优势，但从 PREVNAR ?产品已知相同的载体可用于多种不同的血清型。
[0190] 肺炎球菌糖可包含制备自肺炎球菌的全长完整糖，和/或可包含全长糖的片段， 即所述糖可比细菌中所见的天然荚膜糖更短。因此，多糖可以解聚，其中解聚在糖纯化过程 中或者之后、但在缀合之前发生。解聚降低糖的链长。可使用解聚以提供对于免疫原性的 最佳链长和/或针对糖的物理可操作性而降低链长。当使用多于一种肺炎球菌血清型时， 则可使用各血清型的完整糖、各血清型的片段，或使用一些血清型的完整糖和其他血清型 的片段。
[0191] 当组合物包括来自血清型4、68、利、14、19?和23?中任一种的糖时，这些糖优选是 完整的。相反，当组合物包含来自血清型18C的糖时，