该糖优选是解聚的。
[0192] 血清型3糖也可以是解聚的，例如，血清型3糖可以经受酸水解（例如，使用乙酸） 以解聚[79]。然后使所得片段氧化以活化（例如，高碘酸盐氧化，可在二价阳离子（例如 MgCl2)存在的情况下），在还原性条件下（例如，使用氰基硼氢化钠）缀合至载体（例如 CRM197)，然后（任选地）在糖中任何未反应的醛可进行加帽（capped)(例如，使用硼氢化 钠）[79]。缀合可以在冻干物质上进行，例如在共冷冻干燥活化的糖和载体之后。
[0193] 血清型1糖可以至少部分去-0-乙酰化，例如通过碱性pH缓冲液处理（诸如通过 使用碳酸氢盐/碳酸盐缓冲液）实现[80]。此类（部分地）去-0-乙酰化的糖可以被氧化 以活化（例如高碘酸盐氧化），在还原条件下（例如，使用氰基硼氢化钠）缀合至载体（例 如，CRM197)，然后（任选地）可对糖中任何未反应的醛加帽（capped)(例如，使用硼氢化 钠）[80]。缀合可以在冻干物质上进行，例如在共冷冻干燥活化的糖和载体之后。
[0194] 血清型19A糖可被氧化以活化（例如，高碘酸盐氧化），在还原性条件下在DMSO 中缀合至载体（例如CRM197)，然后（任选地）糖中任何未反应的醛可被加帽（例如，使用 硼氢化钠）[84]。偶联可以在冻干物质上进行，例如在共冷冻干燥活化的糖和载体之后。
[0195] 肺炎球菌缀合物可以理想地引发结合相关糖的抗荚膜抗体，例如，引发2〇. 20 μ g/ mL的抗-糖抗体水平[85]。可以通过酶免疫测定（EIA)和/或调理素吞噬活性（OPA)的 测量来评估抗体。EIA方法已经广泛验证并且在抗体浓度和疫苗效力之间存在关联。
[0196] 通用 术语"包含"涵盖"包括"以及"由……组成"，例如，"包含"x的组合物可以仅由X组成 或可包括额外物质，例如X+Y。
[0197] 词语"基本上"不排除"完全地"，例如"基本上不含" Y的组合物可以完全不含Y。 必要时，词语"基本上"可以从本发明的定义中省略。
[0198] 与数值X相关的术语"约"是任选的，并且意指，例如x±10%。
[0199] 除非特别说明，包括混合两种或更多种组分的步骤的方法不要求混合的任何特定 顺序。因此，组分可以任何顺序混合。当存在三种组分时，则两种组分可以彼此组合，然后 该组合可以与第三组分组合，等。
[0200] 当将抗原描述为"吸附"至佐剂时，优选至少50% (以重量计）的该抗原被吸附， 例如50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、95 %、98 %或更多。优选白喉类毒素和破伤风类毒素都被 全部吸附，即在上清液中都不可检测。可以使用HBsAg的全部吸附。
[0201] 缀合物的量通常以糖的质量给出（即，缀合物（载体+糖）的剂量作为整体将高 于所述剂量）以避免由于载体选择导致的变化。
[0202] 当动物（特别是牛）材料在细胞培养中使用时，它们应当获得自不具有传染性海 绵状脑病（TSE)、特别是不具有牛海绵状脑病（BSE)的来源。
[0203] 实施本发明的方式 用于保护免于破伤风的Tt-缀合物 为了评估缀合物中的Tt是否可以体内保护免于破伤风毒素的致死攻击（根据欧洲药 典2. 7. 8)，未引发的小鼠用MENIT0RIX? (其中两个多糖组分缀合至Tt的二价MenC/Hib缀 合物）免疫。
[0204] 根据其SmPC，MENIT0RIX?含有约17. 5 Pg Tt。两组小鼠（各8只动物）接受一 部分MENITORIX TM，使得每只小鼠用10. 5 Pg Tt (第1组）或2. I Pg Tt (第2组）皮下 免疫。接种后四周，小鼠用破伤风毒素攻击，并且在第1组中，所有小鼠均存活。在第2组 中，八只小鼠中的六只（80% )存活。在使用二价'Td-pur'疫苗的阳性对照组中，100%的 小鼠存活，而在对照组中，所有小鼠都死亡。
[0205] 用于保护免于白喉的Dt-缀合物 为了评估缀合物中的Dt是否可以保护免于白喉毒素的致死攻击，豚鼠用 MENACTRA ? (基于Dt的四价脑膜炎球菌缀合物，其中Dt浓度为~48 Pg/O. 5ml人剂量）免 疫。五只动物两次接受人剂量，其中接种间隔为14天。第二次免疫后两周，豚鼠用白喉毒 素攻击。五只动物中的四只存活。在阳性对照中，所有动物均存活，且阴性对照组中无一存 活。
[0206] 用于保护免于白喉的CRM197-缀合物 为了评估CRM197缀合物是否可以赋予针对白喉毒素的致死攻击的保护，豚鼠用 MENVE0? (四价脑膜炎球菌ACWY缀合物疫苗，具有~40 Pg CRM197/剂量）免疫。使用两 组，每组10只动物。第1组用20 Pg CRM197免疫一次，且组接受约8 Pg CRM197。用白喉 毒素攻击后，第1组或第2组中都没有动物存活，而在用DTP疫苗的阳性对照组中，100%的 动物存活。
[0207] 为了研究佐剂是否可以改善CRM197的保护，使用MENJUGATE? (基于CRM197和含 有12. 5-25 μ g/剂量、具有氢氧化铝佐剂的单价脑膜炎球菌血清群C疫苗）。一组10只豚 鼠用约6 Pg CRM197/动物免疫一次。没有动物存活。阳性对照中的所有动物均存活，但阴 性对照组中没有动物存活。
[0208] 为了研究更高剂量是否可以改善CRM197的保护，使用双倍剂量。使用两次免疫， 各具有含有~40 Pg CRM197的完全人剂量。第一次免疫后14天给予第二次剂量，且在其后 14天实施致死攻击。用MENVEO?接种两次的组中的五只豚鼠中，所有动物都死亡，而在阳性 对照组中，所有动物都存活。
[0209] 用SYNFLORIX ?中的Dt载体的实验 上述实验研究脑膜炎球菌多糖的缀合物，并且显示，偶联至作为载体的Dt的脑膜炎球 菌多糖在豚鼠中针对白喉毒素的致死攻击是保护性的。进一步实验看看Dt载体使用来自 另一种细菌（例如肺炎链球菌）的糖是否也可以是保护性的。这些实验使用SYNFLORIX?。 这是10价肺炎球菌缀合物疫苗，其中10种血清型中的8种（1、4、5、6B、7F、9V、14和23F) 的多糖都偶联至源自非分型的流感嗜血杆菌的蛋白D，并且血清型18C多糖缀合至破伤风 类毒素。只有血清型19F的多糖缀合至Dt (3-6 Pg Dt/疫苗剂量）。SYNFLORIX?用磷酸 错佐剂化。
[0210] 五只豚鼠各自用SYNFLORIX?的人疫苗剂量接种一次，并且五只动物的比较组用 MENJUGATE? (各自具有一个人疫苗剂量）接种。用SYNFLORIX?接种的五只豚鼠在随后用 白喉毒素攻击之后存活，而用MENJUGATE?接种的五只豚鼠死亡（也如上述先前实验中看 到）。
[0211] 该实验证实，用作缀合物疫苗的载体的Dt的保护性免疫独立于多糖来源的性质， 并且如果缀合至脑膜炎球菌和肺炎球菌多糖，则其保护效力不受负面影响。
[0212] 概述 实验结果概述如下：
[0213] 结论 甚至当它们仅作为缀合物疫苗的载体蛋白存在时，Dt和Tt可以赋予针对白喉毒素或 破伤风毒素的致死攻击的保护，而CRM197突变体不是保护性的。
[0214] 参考文献1报道，作为肺炎球菌缀合物疫苗中的载体蛋白的Tt和Dt可以保护免 于破伤风毒素或白喉毒素的致死攻击，并且作者在第[0041]段中宣称，用CRM197将看到相 同效果。本发明人已经显示，CRM197与作为缀合物疫苗的部分的Dt相比令人惊讶地是较 弱的免疫原，尽管基于CRM197的缀合物仍然是保护免于连接的糖指定的细菌疾病的有效 疫苗。
[0215] 因此，当开发超过现有六价疫苗（D+T+Pa+Hib+HBsAg+IPV)的组合疫苗时，可以添 加脑膜炎球菌缀合物如MenC-Tt或MenC-Dt和去除现有的Dt或Tt组分，但MenC-CRM197 不可以以这种方式使用。因此，有用的组合疫苗将是D+Pa+Hib+HBsAg+IPV+MenC-Tt或 T+Pa+Hib+HBV+IPV+MenC-Dt 〇
[0216] 如果Tt用作Hib的载体且Dt用于MenC (和任选用于进一步脑膜炎球菌血清群）， 可以去除Tt和Dt两者，以得到Pa+Hib-Tt+HBV+IPV+MenC-Dt，从而降低抗原复杂性，而不降 低保护的宽度。该组合包括五种组分（如果Pa被认为是单一组分），但具有与7价疫苗相 同的疾病覆盖范围。对于一进一步效价（one further valence)仍然存在空间，而不会变 得比当前市售6价疫苗更复杂。
[0217] 相反，在缀合物疫苗的背景下CRM197是比Dt更弱的免疫原的事实使得当缀合物 疫苗与当前婴儿组合疫苗同时给予时该蛋白是有吸引力的载体，因为对于载体蛋白诱导的 负面干扰存在较低可能。因此，从可用的MenC缀合物疫苗来看，当与当前儿科疫苗结合使 用时，MENJUGATE ?和MENINGITEC ?将优于NEISVAC-C ? (其具有Tt载体）。类似地，从可 用的MenACWY缀合物疫苗来看，当与当前儿科疫苗结合使用时，MENVEO ?将优于NMENRIX ? (其具有Tt载体）和MENACTRA ? (Dt载体）。此外，从可用的多价肺炎球菌缀合物疫苗来 看，当与当前儿科疫苗结合使用时，PREVNAR?和PREVNAR13?将优于SYNFL0RIX? (其包括 Dt和Tt载体）。
[0218] 应当理解，本发明仅通过实例的方式进行描述，并且可进行修改，而仍在本发明的 范围和精神之内。
[0219] 参考文献：
【主权项】
1. 用于针对多种病原体免疫婴儿的方法，其包括用（a)含有未缀合的白喉类毒素、但 不含有未缀合的破伤风类毒素的疫苗；和（b)含有缀合至破伤风类毒素载体的糖的疫苗共 同免疫婴儿的步骤。2. 用于针对多种病原体免疫婴儿的方法，其包括用（a)含有未缀合的破伤风类毒素、 但不含有未缀合的白喉类毒素的疫苗；和（b)含有缀合至白喉类毒素载体的糖的疫苗共同 免疫婴儿的步骤。3. 权利要求1或权利要求2的方法，其中所述婴儿接受含有（a)的未缀合的类毒素和 (b)的缀合的类毒素的单一疫苗。4. 用于针对多种病原体免疫婴儿的方法，其包括用（a)含有至少一种免疫原、但不含 未缀合的破伤风类毒素且不含未缀合的白喉类毒素的疫苗；(b)含有缀合至破伤风类毒素 载体的糖的疫苗；和（c)含有缀合至白喉类毒素载体的糖的疫苗共同免疫婴儿的步骤。5. 权利要求3的方法，其中所述婴儿接受含有（a)的免疫原和（b)和（c)的缀合的类 毒素的单一疫苗。6. 用于针对脑膜炎球菌疾病和破伤风免疫婴儿的方法，其包括施用含有缀合至破伤风 类毒素载体的脑膜炎球菌荚膜糖的疫苗而不施用未缀合的破伤风类毒素的步骤。7. 用于针对脑膜炎球菌疾病和白喉免疫婴儿的方法，其包括施用含有缀合至白喉类毒 素载体的脑膜炎球菌荚膜糖的疫苗而不施用未缀合的白喉类毒素的步骤。8. 任一前述权利要求的方法，其中所述婴儿在免疫时对于破伤风类毒素（Tt)和/或白 喉类毒素（Dt)是免疫上幼稚的。9. 组合疫苗，其包含未缀合的白喉类毒素和缀合至破伤风类毒素载体的糖，但不含未 缀合的破伤风类毒素。10. 组合疫苗，其包含未缀合的破伤风类毒素和缀合至白喉类毒素载体的糖，但不含未 缀合的白喉类毒素。11. 组合疫苗，其包含缀合至破伤风类毒素载体的糖和缀合至白喉类毒素载体的糖，但 不含未缀合的破伤风类毒素且不含未缀合的白喉类毒素。12. 权利要求9的疫苗，其任选用于进行权利要求1或权利要求6的方法，其中所述疫 苗包含（i)脑膜炎球菌荚膜糖与破伤风类毒素的缀合物，（ii)Hib荚膜多糖与破伤风类毒 素的缀合物，和/或（iii)肺炎球菌荚膜糖与破伤风类毒素的缀合物。13. 权利要求12的疫苗，其中所述疫苗包含缀合至破伤风类毒素的来自脑膜炎球菌血 清群C的荚膜糖。14. 权利要求13的疫苗，其中所述疫苗包含来自脑膜炎球菌血清群C和Y的荚膜糖，其 各自缀合至破伤风类毒素。15. 权利要求14的疫苗，其中所述疫苗包含来自脑膜炎球菌血清群A、C、W135和Y的 荚膜糖，其各自缀合至破伤风类毒素。16. 权利要求12至15中任一项的疫苗，其进一步包含以下中的2种、3种或4种：未缀 合的白喉类毒素；一种或多种无细胞百日咳抗原；灭活的脊髓灰质炎病毒；和/或乙型肝炎 病毒表面抗原。17. 权利要求10的疫苗，其任选用于进行权利要求2或权利要求7的方法，其中所述疫 苗包含（i)脑膜炎球菌荚膜糖与白喉类毒素的缀合物，（ii)Hib荚膜多糖与白喉类毒素的 缀合物，和/或（iii)肺炎球菌荚膜糖与白喉类毒素的缀合物。18. 权利要求17的疫苗，其中所述疫苗包含缀合至白喉类毒素的来自脑膜炎球菌血清 群C的荚膜糖。19. 权利要求18的疫苗，其中所述疫苗包含来自脑膜炎球菌血清群A、C、W135和Y的 荚膜糖，其各自缀合至白喉类毒素。20. 权利要求17至19中任一项的疫苗，其进一步包含以下中的2种、3种或4种：未缀 合的破伤风类毒素；一种或多种无细胞百日咳抗原；灭活的脊髓灰质炎病毒；和/或乙型肝 炎病毒表面抗原。21. 权利要求11的疫苗，其任选用于进行权利要求4的方法，其中所述疫苗包含（i) 脑膜炎球菌荚膜糖与破伤风类毒素的缀合物，（ii)Hib荚膜多糖与破伤风类毒素的缀合物， (iii)肺炎球菌荚膜糖与破伤风类毒素的缀合物，（iv)脑膜炎球菌荚膜糖与白喉类毒素的 缀合物，（V)Hib荚膜多糖与白喉类毒素的缀合物，和/或（vi)肺炎球菌荚膜糖与白喉类毒 素的缀合物。22. 权利要求21的疫苗，其中所述疫苗包含缀合至破伤风类毒素的Hib荚膜糖，和缀合 至白喉类毒素的脑膜炎球菌荚膜糖。23. 权利要求22的疫苗，其中所述疫苗包含：缀合至破伤风类毒素的Hib荚膜糖；和来 自脑膜炎球菌血清群A、C、W135和Y的荚膜糖，其各自缀合至白喉类毒素。24. 权利要求22的疫苗，其中所述疫苗包含：缀合至白喉类毒素的Hib荚膜糖；和来自 脑膜炎球菌血清群A、C、W135和Y的荚膜糖，其各自缀合至破伤风类毒素。25. 权利要求21至24中任一项的疫苗，其进一步包含以下中的1种、2种或3种：一种 或多种无细胞百日咳抗原；灭活的脊髓灰质炎病毒；和/或乙型肝炎病毒表面抗原。26. 权利要求9至25中任一项的疫苗，其包括至少一种铝盐佐剂。27. 试剂盒，其包含至少两种试剂盒组分，所述试剂盒组分当混合时，导致权利要求9 至26中任一项的组合疫苗。28. 用于针对多种病原体免疫婴儿的方法，其包括用（a)含有白喉类毒素和破伤风类 毒素的疫苗；和（bl)含有缀合至CRM197载体的脑膜炎球菌荚膜糖的疫苗；(b2)含有缀合 至CRM197载体的肺炎球菌荚膜糖的疫苗；(b3)含有缀合至CRM197载体的脑膜炎球菌荚 膜糖的第一疫苗和含有缀合至CRM197载体的肺炎球菌荚膜糖的第二疫苗；或（b4)含有各 自缀合至CRM197载体的肺炎球菌和脑膜炎球菌荚膜糖的疫苗中的一种共同免疫婴儿的步 骤。
【专利摘要】使用白喉类毒素或破伤风类毒素作为载体蛋白的糖缀合物疫苗可以赋予针对白喉毒素或破伤风毒素的致死攻击的保护。因此，除了保护免受其糖类已经连接至载体的细菌影响以外，此类缀合物疫苗也可以用于保护免于白喉和破伤风，所以当前复杂组合疫苗的白喉类毒素和破伤风类毒素组分可以是多余的。因此，可以降低这些疫苗的抗原复杂性，而不降低其保护宽度，并且去除这些多余组分在疫苗中产生空间用于添加免疫原用于保护免受进一步病原体的影响。用CRM197载体看不到相同的效果，但该观察使得该载体对于与含有Dt和Tt的婴儿组合疫苗伴随给予的缀合物疫苗更有吸引力。
【IPC分类】A61K39/00, C07H1/00
【公开号】CN105007935
【申请号】CN201380073242
【发明人】M.布勒克
【申请人】葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2013年12月16日
【公告号】CA2894260A1, EP2934574A1, US20150320852, WO2014095771A1