多聚化技术的制作方法
【专利说明】多聚化技术
[000。相关申请案交叉引用
[0002]本申请要求2013年3月15日提交的美国临时专利申请序号61/791，600的35 U.S.C.§119(e)的权益，所述申请W全文引用的方式并入本文。
[000；3] 序列表
[0004] 本说明书参考2014年3月14日W名称为"2003080-0636_ST25"的ascii.txt文件的 电子形式提交的序列表。.txt文件产生于2014年3月7日且大小为100化。
【背景技术】
[0005] 当前正开发用于多种治疗、诊断和研究应用的双特异性和多特异性结合剂。许多 此类药剂由将祀向不同抗原的抗体组分彼此缔合，例如W融合蛋白形式或通过抗体组分的 交联产生。此类方法尤其包括通过各自表达单特异性抗体的细胞的融合(例如融合瘤）、两 个或两个W上单特异性抗体的化学共辆和/或重组DNA技术产生多特异性抗体。但是，此类 方法不受限制。
[0006] 确切地说，重组DNA技术已产生若干多特异性和多功能性的工程改造抗体。随着单 链Fv分子的出现，已取得工程改造抗体中的许多进步。此类工程改造抗体已展现相比于传 统抗体改进的特性，其至少部分归因于已产生的独特形式。尽管存在若干用于工程改造多 特异性抗体药剂的策略，大部分努力聚焦于仅改进某些功能方面。因此，由抗体组分制得的 大部分工程改造蛋白质不具有将带来大部分药理学意义的所有所需功能特性。
【发明内容】
[0007] 本发明尤其提供包括多聚化组分的改进的多特异性结合剂。此类提供的药剂具有 相比于不具有此类多聚化组分的亲本结合剂改进的功能特性。
[000引在某些实施例中，提供的药剂由个别多肤组成，其中的每一者包括至少一个，且更 通常至少两个或两个W上特异性地与特定标祀相互作用的结合部分。在多个实施例中，此 类结合部分为抗体组分或包含抗体组分。在一些实施例中，本发明尤其提供包含具有包含 至少抗体5F11的结合元件的氨基酸序列的抗体组分的多肤。根据本发明，提供的药剂内的 此类个别多肤经工程改造验W包括多聚化组分。在多个实施例中，此类多肤包括二聚化组 分。在多个实施例中，二聚化组分为人类肝细胞核因子-化的元件。
[0009] 在本文所述的某些特定实施例中，提供的药剂包含经工程改造 W含有多聚化组分 的双特异性抗体多肤。
[0010] 在一些实施例中，本发明提供包含两个融合蛋白的双特异性结合剂，其中的每一 者包含结合第一抗原的第一抗体组分;结合第二抗原的第二抗体组分，和包含人类肝细胞 核因子-Ια化NF-la)元件的二聚化组分。
[0011] 在一些实施例中，本发明的第一和第二抗原是不相同的。在一些实施例中，本发明 的第一抗原为肿瘤抗原。在一些实施例中，肿瘤抗原与B细胞或T细胞相关。在一些实施例 中，本发明的肿瘤抗原为GD2。在一些实施例中，本发明的肿瘤抗原为GD3。
[0012] 在一些实施例中，本发明的第二抗原存在于Τ细胞上。在一些实施例中，本发明的 第二抗原为CD3。
[0013] 在一些实施例中，本发明的二聚化组分具有与人类HNF-la(SEQ ID Ν0:1)的氨基 酸残基 1-32 具有至少约 50%(例如至少约55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、 95 %、96 %、97 %、98 %或99 % ) -致性的序列。在一些实施例中，本发明的二聚化域具有与 人类HNF-la(SEQ ID NO: 1)的氨基酸残基1-32实质上一致的序列。在一些实施例中，本发明 的二聚化域包含人类HNF-la(SEQ ID NO: 1)的氨基酸残基1-32。在一些实施例中，本发明的 二聚化域为人类HNF-la(SEQ ID N0:1)的氨基酸残基1-32。
[0014] 在一些实施例中，本发明的双特异性粘合剂具有与SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、 SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO:10、沈Q ID NO:11、沈Q ID NO:12、沈Q ID NO:13、沈Q ID NO:14、沈Q ID NO:15、SEQ IDN0:16、WQIDN0:17、WQIDN0:18、WQIDN0:19、WQIDN0:20、WQIDN0:21、WQ 10^:22或沈9 10^:23具有至少约50%(例如至少约55%、60%、65%、70%、75%、80%、 85%、90%、95%、96%、97%、98%或99% ) -致性的序列。
[0015] 在一些实施例中，本发明的双特异性粘合剂具有与SEQ ID:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、沈Q ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、沈Q ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO:10、沈Q ID NO:11、沈Q ID NO:12、沈Q ID NO:13、沈Q ID NO:14、沈Q ID NO:15、沈Q ID N0:16、WQIDN0:17、WQIDN0:18、WQIDN0:19、WQIDN0:20、WQIDN0:21、WQID NO:22或沈Q ID NO:23实质上一致的序列。
[0016] 在一些实施例中，本发明的双特异性粘合剂具有与SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、 SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO:10、沈Q ID NO:11、沈Q ID NO:12、沈Q ID NO:13、沈Q ID NO:14、沈Q ID NO:15、SEQ IDN0:16、WQIDN0:17、WQIDN0:18、WQIDN0:19、WQIDN0:20、WQIDN0:21、WQ ID NO :22或沈Q ID NO :23-致的序列。
[0017] 在一些实施例中，本发明的双特异性粘合剂包含选自SEQ ID N0:2、沈Q ID N0:3、 SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO:10、沈Q ID NO:11、沈Q ID NO:12、沈Q ID NO:13、沈Q ID NO:14、沈Q ID NO:15、SEQ IDN0:16、WQIDN0:17、WQIDN0:18、WQIDN0:19、WQIDN0:20、WQIDN0:21、WQ ID NO :22或沈Q ID NO :23的序列。
[0018] 在一些实施例中，提供包含本发明的双特异性粘合剂和药学上可接受的载剂的药 物组合物。
[0019] 在一些实施例中，提供融合蛋白，其从5'到3'包含第一抗体组分、第二抗体组分和 包含人类肝细胞核因子-Ια化NF-la)元件的二聚化组分。在一些实施例中，人类HNF-化元件 包含人类HNF-化的氨基酸残基1-32。
[0020] 在一些实施例中，本发明的融合蛋白的第一和第二抗体组分为单链可变区片段 (scFvs)。
[0021] 在一些实施例中，本发明的融合蛋白的第一scFv结合到肿瘤抗原。在一些实施例 中，本发明的融合蛋白的第一scFv结合到为GD2的肿瘤抗原。在一些实施例中，本发明的融 合蛋白的第一scFv结合到为GD3的肿瘤抗原。
[0022] 在一些实施例中，本发明的融合蛋白的第二scFv结合到存在于Τ细胞上的抗原。在 一些实施例中，本发明的融合蛋白的第二scFv结合到为CD3的存在于Τ细胞上的抗原。
[0023] 在一些实施例中，本发明的融合蛋白具有与SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、沈Q ID NO: 10、沈Q ID N0:11、SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:15、SEQ ID N0:16、WQIDN0:17、WQIDN0:18、WQIDN0:19、WQIDN0:20、WQIDN0:21、WQID N0:22或SEQ ID N0:23具有至少约50%(例如至少约55%、60%、65%、70%、75%、80%、 85%、90%、95%、96%、97%、98%或99% ) -致性的序列。
[0024] 在一些实施例中，本发明的融合蛋白具有与沈Q ID: 2、沈Q ID NO: 3、沈Q ID NO: 4、沈Q ID N0:5、沈Q ID N0:6、沈Q ID N0:7、沈Q ID N0:8、沈Q ID N0:9、沈Q ID N0:10、 SEQIDN0:11、WQIDN0:12、SEQIDN0:13、SEQIDN0:14、SEQIDN0:15、SEQIDN0: 16、沈Q ID N0:17、SEQ ID N0:18、SEQ ID N0:19、SEQ ID N0:20、沈Q ID N0:21、SEQ ID NO:22或沈Q ID NO:23实质上一致的序列。
[00巧]在一些实施例中，本发明的融合蛋白具有与沈Q ID: 2、沈Q ID NO: 3、沈Q ID NO: 4、沈Q ID N0:5、沈Q ID N0:6、沈Q ID N0:7、沈Q ID N0:8、沈Q ID N0:9、沈Q ID N0:10、 SEQIDN0:11、WQIDN0:12、SEQIDN0:13、SEQIDN0:14、SEQIDN0:15、SEQIDN0: 16、沈Q ID N0:17、SEQ ID N0:18、SEQ ID N0:19、SEQ ID N0:20、沈Q ID N0:21、SEQ ID NO :22或沈Q ID NO :23-致的序列。
[00%] 在一些实施例中，本发明的融合蛋白包含选自SEQ ID:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、沈Q ID NO: 10、沈Q ID N0:11、SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:15、SEQ ID N0:16、WQIDN0:17、WQIDN0:18、WQIDN0:19、WQIDN0:20、WQIDN0:21、WQID NO :22或沈Q ID NO :23的序列。
[0027] 在一些实施例中，提供包含两个本发明的融合蛋白的二聚双特异性粘合剂。
[0028] 在一些实施例中，提供包含含两个本发明的融合蛋白的二聚双特异性粘合剂和药 学上可接受的载剂的药物组合物。
[0029] 在一些实施例中，提供编码本发明的融合蛋白的核酸序列。
[0030] 在一些实施例中，提供包含本发明的核酸序列的载体。
[0031] 在一些实施例中，提供包含本发明的载体的宿主细胞。在一些实施例中，本发明的 宿主细胞选自由W下组成的群组:细菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞。在一些实施例中，本发 明的宿主细胞选自由W下组成的群组:大肠杆菌、甲醇酵母、S巧、COS、HEK293和C册细胞。
[0032] 在一些实施例中，提供产生本发明的二聚双特异性结合剂的方法，所述方法包含 在适合于表现二聚双特异性粘合剂的条件下培养含有包含编码本发明的融合蛋白的核酸 序列的载体的宿主细胞，和回收二聚双特异性结合剂。
[0033] 在一些实施例中，在提供包含包括第一和第二抗体组分的双特异性抗体药剂的高 亲和力双特异性抗体组合物的方法中，提供一改进，所述改进包含将此类第一和第二抗体 组分中的至少一个提供为与由人类HNF-化二聚化元件组成的二聚化组分的融合物，W使得 抗体组分-二聚化组分融合物能够形成同型二聚体。在一些实施例中，本发明的二聚化组分 包含人类HNF-化的氨基酸残基1-32。
[0034] 在一些实施例中，提供杀死肿瘤细胞的方法，所述方法包含W下步骤:使肿瘤细胞 与双特异性结合剂接触，所述结合剂包含两个从5 '到3 '各自包含结合到肿瘤抗原的第一抗 体组分、结合到T细胞上的CD3的第二抗体组分和包含人类HNF-化元件的二聚化组分的融合 蛋白，使得双特异性结合剂能够二聚化W形成同型二聚体，接触在同型二聚体所结合的T细 胞足W介导杀死肿瘤细胞的条件和时间下进行。在一些实施例中，本发明的二聚化组分包 含人类HNF-la的氨基酸残基1-32。在一些实施例中，本发明的双特异性结合剂的第一和第 二抗体组分为单链可变区片段(scFvs)。在一些实施例中，本发明的肿瘤抗原为GD2。在一些 实施例中，本发明的肿瘤抗原为GD3。
[0035] 在一些实施例中，提供抑制肿瘤生长的方法，所述方法包含W下步骤:使肿瘤与双 特异性结合剂接触，所述结合剂包含两个从5 '到3 '各自包含结合到肿瘤抗原的第一抗体组 分、结合到T细胞上的CD3的第二抗体组分和包含人类HNF-la元件的二聚化组分的融合蛋 白，使得双特异性结合剂能够二聚化W形成同型二聚体，接触在同型二聚体所结合的T细胞 足W抑制肿瘤生长的条件和时间下进行。在一些实施例中，本发明的二聚化域包含人类 HNF-la的氨基酸残基1-32。在一些实施例中，本发明的双特异性结合剂的第一和第二抗体 组分为单链可变区片段(scFvs)。在一些实施例中，本发明的肿瘤抗原为GD2。在一些实施例 中，本发明的肿瘤抗原为GD3。
[0036] 在一些实施例中，提供双特异性结合剂，所述结合剂包含两个从5 '到3 '各自包含 结合到肿瘤抗原的第一抗体组分、结合到T细胞上的CD3的第二抗体组分和包含人类HNF-la 元件的二聚化组分的融合蛋白，使得双特异性结合剂能够二聚化W形成同型二聚体;其中 同型二聚体的特征在于相比于不包含二聚化组分的其它方面类似的双特异性结合剂，半衰 期较长。在一些实施例中，本发明的二聚化组分包含人类HNF-la的氨基酸残基1-32。在一些 实施例中，本发明的双特异性结合剂的第一和第二抗体组分为单链可变区片段(scFvs)。在 一些实施例中，本发明的肿瘤抗原为GD2。在一些实施例中，本发明的肿瘤抗原为GD3。
【附图说明】
[0037] 包含W下诸图的本文中包括的图式仅出于说明的目的而非限制性的。
[003引图1不按比例地显示scFv日F1广scFv日kt3(GD2XCD3)和二聚scFv日F1广scFv日KT3-HDD双 特异性结合剂的示意图。
[0039] 图2A显示GD2XCD3和GD2XCD3-皿D双特异性结合剂的GD2结合(上图）和杰卡特细 胞上的CD3结合(下图）的化ISA结合曲线。
[0040] 图2B显示GD2 X CD3和GD2 X CD3-HDD双特异性结合剂的杰卡特细胞上的CD3结合。
[0041 ] 图3A和3B显示GD2 X CD3和GD2 X CD3-皿D双特异性结合剂的GD2结合的Biacore传 感图。显示W下双特异性抗体浓度处的痕量:62.5、125、250、500、1000、2000nM。
[0042] 图4显示GD2 X CD3和GD2 X CD3-皿D双特异性结合剂的黑素瘤和神经母细胞瘤细胞 系的T细胞介导的体外杀死的百分比。
[0043] 图5显示植入到异种移植研究模型的对照(无处理）、GD2 X CD3和GD2 XCD3-HDD处 理组中的BALB/cA-Rag2K(V比-2R 丫 K0(DK0)小鼠中的皮下SKNLD肿瘤的肿瘤体积(mm3)。
[0044] 图6显示植入到异种移植研究模型的对照(无处理KGD2XCD3和GD2XCD3-HDD处 理组中的BALB/cA-Rag2K(V比-2R 丫 KO(DKO)小鼠中的皮下M14肿瘤的肿瘤体积(mm3)。
[0045] 图7显示3LHBT和3LHBT-HDD双特异性结合剂的GD2结合的ELISA结合曲线。
[0046] 图8显示具有不同二聚化域的GD2XCD3双特异性结合剂的GD2结合的化ISA结合曲 线。
[0047] 图9显示具有不同二聚化域的GD2XCD3双特异性结合剂的黑素瘤和神经母细胞瘤 细胞系的T细胞介导的体外杀死的百分比。
【具体实施方式】
[0048] 本发明不限于描述的特定方法和实验条件，因此方法和条件可W变化。还应了解， 本文中所使用的术语仅仅是为了描述特定实施例，而并不意图为限制性的，除非指示如此， 运是由于本发明的范围将仅仅受到所附权利要求书的限制。
[0049] 除非另有说明，否则本文中所用的所有技术和科学术语和短语均具有与所属领域 的技术人员通常所理解相同的含义。尽管在本发明的操作或测试中也可W使用与本文中描 述的方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但是现在描述优选的方法和材料。本文中 所提及的所有公开案都W引用的方式并入。
[00加]定义
[0051] 为了使本发明更易于理解，在下文中首先对某些术语进行定义。W下术语和其它 术语的其它定义阐述在整个说明书中。
[0052] 除非上下文另外明确规定，否则如在本说明书和所附权利要求书中所使用的单数 形式"一个/种(a/an)"和"所述"包括复数个指示物。因此，举例来说，提及的"一种方法"包 括一或多种本文所述类型和/或所属领域的技术人员在阅读本发明之后将变得显而易见等 方法和/或步骤。
[0053] 如本文所用，"亲和力成熟"（或"亲和力成熟抗体"）是指在抗体的一或多个CDR中 具有一或多个改变的抗体，所述改变导致相比于不具有那些改变的亲本抗体的抗体对于抗 原的亲和力的改进。在一些实施例中，亲和力成熟抗体对标祀抗原将具有纳摩尔或甚至皮 摩尔的亲和力。亲和力成熟抗体可通过所属领域中已知的多种程序中的任一种产生。马克 斯(Marks)等人生物技术(BioTechnology) 10:779-783( 1992)描述通过Vh和化域改组产生的 亲和力成熟。CDR和/或构架残基的随机突变诱发由W下各者描述：己己斯(Barbas)等人美 国国家科学院院刊(Proc 化t.Acad. Sci，USA)91:3809-3813( 1994);希尔（Schier)等人基 因（Gene) 169:147-155( 1995);耶尔顿(Yelton)等人免疫学杂志（J. Immunol. )155:1994-2004( 1995);杰克逊（Jackson)等人，免疫学杂志154( 7) :3310-9(1995): W及霍金斯 化awkins)等人，分子生物学杂志(J.Mol.Biol. )226:889-896( 1992)。
[0054] 如本文所用，"抗体"具有其技术理解如本文所用，"抗体"具有其技术理解含义且 是指特异性结合于特定抗原的免疫球蛋白（Ig)。如所属领域的一般技术人员所已知，在自 然界中产生的抗体通常包含四个多肤链，两个重化)链和两个轻化)链。每一重链和轻链包 含可变区（在本文中分别缩写为肥VR或Vh和LCVR或Vl)和恒定区。重链的恒定区包含扣1、姑2 和姑3域(和任选地Ch4域，在IgM和I姐的情况下）。轻链的恒定区包含一个域(CL)。Vh和化区 可W进一步含有高变区，称为互补决定区（CDR)，穿插有称为构架区(FR)的更保守区。每一 Vh和Vl包含Ξ个CDR和四个FR，从氨基末端到簇基末端按W下次序配置:FR1、CDR1、FR2、 CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可W是任何类型（例如IgM、I曲、IgG、IgA和I巧）、类别 (例如 I gGi、I g