(例如经口或经鼻）。在一些实施例中，本发明的多特异性结合剂经静脉内投 与。在一些实施例中，本发明的多特异性结合剂经皮下投与。在一些实施例中，多特异性结 合剂连同其它生物活性剂一起投与。
[0164] 药物组合物
[0165] 本发明进一步提供包含本发明的多特异性结合剂和药学上可接受的载剂或赋形 剂的药物组合物。组合物必要时也可W含有一或多种额外治疗活性物质。
[0166] 尽管本文提供的药物组合物的描述大体上设及适合于向人类的伦理投与的药物 组合物，所属领域的技术人员应了解，此类组合物总体上适合于向所有类型的动物投与。使 得组合物适合于向各种动物投与的适合于向人类投与的药物组合物的修改经充分理解，且 一般兽医药理学家可W仅用一般实验(如果存在)设计和/或进行此类修改。
[0167] 本文中所描述的药物组合物的调配物可W通过药理学技术中已知或此后研发的 任何方法制备。一般来说，此类制备型方法包括使活性成分与稀释剂或另一赋形剂和/或一 或多种其它助剂缔合，且随后必要时和/或需要时将产物成形和/或包装为所需单剂量或多 剂量单位的步骤。
[0168] 根据本发明的药物组合物可W散装、W单一单位剂量形式和/或W多个单一单位 剂量形式制备、包装和/或出售。如本文中所用，"单位剂量"是包含预定量的活性成分的药 物组合物的个别量。活性成分的量通常等于将向受试者投与的活性成分的剂量或此剂量的 适宜部分，如此剂量的一半或Ξ分之一。
[0169] 根据本发明的药物组合物的活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何其它成 分的相对量将变化，其取决于所治疗的受试者的身份、身材和/或情况并且进一步取决于投 与组合物的途径。举例来说，组合物可W包含0.1%与100%(w/w)之间的活性成分。
[0170] 药物调配物可W另外包含药学上可接受的赋形剂，其如本文中所用包括任何和所 有溶剂、分散介质、稀释剂、或其它液体媒剂、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等张剂、增稠或 乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等，如适于所需特定剂型。雷明顿氏药学科学和实践 (Remington's The Science and Practice of 化armacy),第21 版，A.R.根纳罗 (八.3.66]1]1日1'〇)(利平科特，威廉姆斯和威尔金斯出版社化199；[]1(3〇1:1:,胖;[111日1113&胖;[化;[]13), 马里兰州己尔的摩(Baltimore,MD) ,2006; W引用的方式并入本文中）公开各种用于配制药 物组合物的赋形剂和用于其制备的已知技术。除非任何常规赋形剂介质均不与物质或其衍 生物相容，如因产生任何非所需生物作用，或另外与医药组合物的任何其它组分W有害方 式相互作用，否则预期其使用在本发明的范围内。
[0171] 在一些实施例中，药学上可接受的赋形剂是至少95%、至少96%、至少97%、至少 98 %、至少99%或100 %纯。在一些实施例中，赋形剂经批准用于人类和供兽用。在一些实施 例中，赋形剂经美国食品和药物管理局批准。在一些实施例中，赋形剂为医药级的。在一些 实施例中，赋形剂符合美国药典化SP)、欧洲药典化P)、英国药典和/或国际药典的标准。
[0172] 用于制造药物组合物的药学上可接受的赋形剂包括(但不限于)惰性稀释剂、分散 和/或粒化剂、表面活性剂和/或乳化剂、崩解剂、结合剂、防腐剂、缓冲剂、润滑剂和/或油。 此类赋形剂可W任选地包括于药物调配物中。如可可脂和栓剂蜡、着色剂、涂层剂、甜味剂、 调味剂和/或芳香剂的赋形剂可W根据调配者的判断存在于组合物中。
[0173] 调配和/或制造药剂中的一般考虑因素可W例如发现于雷明顿：医药科学和实践 第21版，利平科特威廉姆斯和维尔金斯出版社，2005( W引用的方式并入本文中）。
[0174] 试剂盒
[0175] 本发明进一步提供包含一或多个用至少一种如本文所述的多特异性结合剂填充 的容器的药物包或试剂盒。试剂盒可w任何可适用方法使用，包括例如诊断上。与此类容器 任选地相关的可W是呈由调控药物或生物产品的制造、使用或出售的政府机构指定的形式 的布告，所述布告反映(a)由所述机构批准制造、使用或出售用于人类投与，（b)使用说明， 或两者。
[0176] 实例
[0177] 现将通过W下非限制性实例进一步说明本发明。阐述运些实例W帮助理解本发 明，但不意图且不应理解为W任何方式限制其范围。实例不包括所属领域的一般技术人员 将众所周知的常规方法(分子选殖技术等)的详细描述。除非另外规定，否则份数是重量份， 分子量是平均分子量，溫度是W摄氏度计并且压力是处于大气压或接近大气压。
[0178] 实例1.设计和构筑具有二聚化组分的双特异性融合蛋白
[0179] 本实例描述产生经特异性工程改造 W能够二聚化来作为增强其肿瘤杀死效能的 策略的多特异性结合剂。此策略测试于可W介导GD2阳性肿瘤细胞的T细胞杀死的双特异性 结合蛋白上。双唾液酸神经节巧脂GD2高度表达于小儿和成人癌症的肿瘤上，包括神经母细 胞瘤、成视网膜细胞瘤、黑素瘤、脑瘤、肉瘤和小细胞肺癌（莫达克(Modak)等人，2007,癌症 调查（Cancer Invest. )25:67-77)。本实例尤其说明称为GD2XCD3-皿D的能够二聚化的融 合蛋白的结构，其由通过HNF-化二聚化组分彼此连接且祀向GD2和CD3的来自抗GD2和抗GD3 抗体的scFv多肤组成。尽管已知HNF-la本身二聚合，但不清楚HNF-la的二聚化组分是否可 用于二聚合其可附接的其它蛋白质，确切地说其抗体或组分。举例来说，本发明人已确定当 附接到抗体组分时，已知自身二聚合的人类肤激素内皮素-UET1)不能够二聚合。
[0180] 本文中呈现的其它实例展示如通过动态光散射检定的此融合蛋白的成功的二聚 化、增加的与GD2的功能亲和力、增强的肿瘤细胞的T细胞介导的体外杀死和植入有肿瘤的 小鼠中的肿瘤生长的抑制。运些实例展示本发明策略增加 T细胞接合抗体对于癌症免疫疗 法的效能的潜能。
[0181] 分子克隆
[0182] 抗GD2X抗CD3串联scFv(GD2XCD3)双特异性结合蛋白在不具有和具有HNF-化二 聚化组分的情况下（称为GD2 X CD3和GD2 X CD3-HDD)构筑自含有抗GD2单克隆抗体5F11的 scFv(胡等人，2009，免疫学杂志（J. Immunol.) 183:5748-5755;张(Cheung)等人，2004，核医 学杂志（J.Nucl.Med. )45:867-877)和抗CD3 0KT3的人类化scFv(伍德尔（Woodle)等人， 1992,免疫学杂志148:2756-2763)的单一多肤链。HDD组分放置在抗GD2 scFv的远端，和抗 CD3 ScFv的近端。不希望受任何特定理论束缚，选择此放置W使对远端抗原(GD2)且并非近 端抗原(CD3)的功能亲和力的潜在增强最大化，其将为几何学上限制的。GD2结合的增强将 大概增强肿瘤杀死，而CD3结合的增强可导致增强的细胞激素风暴，T细胞接合双特异性抗 体的已知副作用（蔡(Choi)等人，2011,生物疗法专家观点化Xpert Opin.Biol .Ther. )11: 843-853)。另外，串联scFv双特异性结合蛋白（MW约55-601d)a)的二聚化具有增强血清半衰 期的可能性，因为均二聚串联scFv双特异性结合蛋白可W避开小于60kDa的蛋白质经受的 肾清除率路径。
[0183] 简单来说，抗GD2抗体5F11和人类化抗CD3 0KT3(衍生自小鼠0KT3抗体)抗体的可 变区已先前地描述。5F11和人类化0KT3化0KT3)抗体的单链可变区片段（scFv)使用15个氨 基酸的连接子（（G4S)3)沿不同定向遗传组装且分开合成(新泽西州皮斯卡塔威基因脚本公 司（Genescript ,Piscataway ,NJ))。使用5F11抗体的可变区构筑Vh化或化Vh定向且使用抗 CD3 hOKT3抗体的可变区构筑Vh化定向。在本发明中利用的抗体组分的特定身份对于添加二 聚化组分改进由祀向两个抗原的抗体组分组成的多特异性结合剂的活性的提供的桐察并 非至关重要。
[0184] 构筑自5F11抗体的单链可变区片段用化el和Apar消化且构筑自h0KT3抗体的scFv 用Apal和BamHI消化。消化片段依序接合到谷脫甘肤合成(GS)载体(茵维特罗根）中W制造 双特异性结合蛋白5HLBT和5LHBT。
[0185] 通过突变诱发根据制造商的说明书（加利福尼亚州斯塔津（S化atagene，CA))对 5F11 scFv的两个半脫胺酸残基（重链S44C，轻链A100C)作出稳定化突变W产生甜LDSBT和 化皿SBT。在5F11 scFv与h0KT3 scFv之间W及5HLDSBT与化皿SBT之间克隆长度为15个 ((G4S)3)或5个(G4S)氨基酸的连接子序列W用于比较。W类似方式，稳定化半脫胺酸突变也 引入到0KT3 scFv中W产生5HLDS-DSBT。另外，两个亲和力成熟突变(P104Y和E31Q;胡等人， 2009，免疫学杂志183:5748-5755)分别引入到5HLDSBT中W分别产生Y-BT和Q-BT。
[0186] 使用W上所描述的方法，基于具有HNF-la二聚化组分的人类化抗GD2抗体3F8(张 等人，2012，肿瘤免疫学（OncoImmunol.) 1:4，477-486)和人类化抗CD3 0KT3(GD2 X CD3)构 筑其它抗GD2 X抗CD3串联scFv(伍德尔等人，前述)双特异性结合蛋白；且基于具有HNF-la 二聚化组分的单克隆抗GD3抗体KM64U太田（Ohta)等人，1993,癌症免疫与免疫疗法 Kancer Immunol. Immunother. )36(4) :26〇-266)和人类化抗CD3 0KT3(伍德尔等人，前述） 构筑抗GD3X抗CD3串联scFv(GD3xCD3)双特异性结合蛋白。二聚化组分使用一部分人类 IgG3较链(TPLGDTTHTSG)融合到抗CD3抗体组分的C末端。如上文所述的示例性融合蛋白显 示于表5中。
[0187] 表5
[018 引
[0189] 产生和纯化
[0190] 表达构筑体使用scFv日m-(G4S)3-scFvh日KT3融合蛋白（Y-BT，沈Q ID ^:10)的0酷在 具有(GD2XCD3-HDD)和不具有(GD2XCD3)含有HNF-化的元件(氨基酸1-32)，接着为6X组 氨酸标签的二聚化组分的情况下制得。DNA通过使用核转染仪II电穿孔机器（阿玛萨 (Amaxa))和核转染溶液V的电穿孔转染到DG44 CH0-S细胞(茵维特罗根）中。经转染的细胞 用50化g/ml G418经受药物选择。在约两周之后，单一细胞通过连续稀释接种到96孔板中。 照射的CH0-S细胞W每孔5000个细胞的浓度用作饲养细胞。来自每一克隆体的上清液经Ξ 周收获且经受GD2结合检定。展示与GD2的最高结合的克隆体选择用于在细胞达到每毫升2 百万个且处于对数期生长时用37°C和8%C02下的12虹pm的轨道震荡按比例增大为大型培 养物。培养物上清液在达到所需抗体产率时或存活力下降到<40%时收获。分泌到培养物上 清液中的双特异性融合蛋白（GD2XCD3和GD2XCD3-皿D)通过Ni化琼脂糖(通用电气医疗集 团生物科学，瑞典)纯化且用300mM咪挫洗脱。
[0191] 实例2.双特异性融合蛋白的体外筛选和亲和力
[0192] 此实例说明根据实例1制得的单链双特异性融合蛋白的二聚化对与其标祀的功能 亲和力的效应。在一些情况下，双特异性单体可W持续短时间周期结合到其标祀(例如由于 尺寸的不佳滞留）。在此实例中，经工程改造 W形成同型二聚体的双特异性融合蛋白展示对 于抗原增加的亲和力。
[0193] 动态光散射
[0194] HNF-la的二聚化组分诱导双特异性融合蛋白中的二聚化的能力通过动态光散射 测试。纯化双特异性融合蛋白使用动态光散射在Zetasizer Nano(马尔文仪器有限公司 (Malvern Instruments,Ltd.))上测量流体动力半径。表6阐述使用在实例1中描述的双特 异性融合蛋白的示例性测量。纯化双特异性融合蛋白的额外样品也使用如上文所述的动态 光散射测量流体动力半径。结果显示于表7中。
[01巧]如表6和7中所示，GD2XCD3(MW 55 kDa)具有7.2±1.7nm的流体动力半径，而GD2 X CD3-皿D(就单体来说的MW 59kDa，就二聚物来说的118W)a)具有13.6 ± 0.化m(或11.1 ± 0.5)的流体动力半径。如通过光散射所展示的尺寸的增加指示GD2 X CD3-HDD的二聚构形。
[0196]
[0197] ELISA 检定
[0198] 为了确定皿D是否增强与GD2或CD3的功能亲和力，使用纯化GD2和杰卡特全细胞 (含有CD3的培养T细胞)进行化ISA检定。简单来说，96孔板在室溫下微克/毫升/孔的含 GD2的90%乙醇涂布过夜。第二天，板在室溫下持续一小时用每孔15化1的0.5%BSA阻断。在 洗涂之后，将稀释系列的双特异性抗体添加到板且在室溫下培育两小时。板随后用PBS洗涂 四次且随后用每孔10化1的1:1000稀释度的含小鼠抗化S标签抗体(AbD SeroteC公司）的 0.5%BSA在室溫下培育一小时。板再用PBS洗涂四次且随后用每孔10化1的1:3000稀释度的 含山羊抗小鼠 HRP抗体(杰克逊免疫研究(Jackson ImmunoResearch))的0.5%BSA在室溫下 培育一小时。板再用PBS洗涂四次且使用每孔15化1的0PD缓冲液（西格马（Sigma))显影。反 应用每孔30μ1的5N也S〇4停止。板随后在分光光度计上在490nm处读取。表8和图2A(上图）阐 述根据实例1制得的双特异性融合蛋白的示例性GD2结合。图2A(下图）阐述根据实例1制得 的双特异性融合蛋白的CD3/杰卡特细胞结合。纯化双特异性融合蛋白的额外样品也关于 CD3/杰卡特细胞结合进行测量。结果显示于图2B中。
[0199] 体外结合动力学使用Biacore T-100生物传感器（通用电气医疗集团（GE Healthcare))测定。CM5传感器忍片和相关试剂购自美国Biacore公司（Biacore USA)。神经 节巧脂GM1购自厄莱克西斯生物化学品公司(ALEXIS BiochemicalsK阿索拉有限责任公司 (AXX0RA L.L.C.)，且GD2购自先进免疫化学公司（Advanced Immuno化emical)。简单来说， 神经节巧脂经由疏水相互作用直接固定到CM5传感器忍片上。参考表面用GM1固定。活性表 面用1:1比率的GD2和GM1固定。GD2和GM1的稀释混合物(50μg/ml)经20分钟W15μ1/π?η的流 动速率注射(300μ1)。接着为用lOmM NaOH的广泛洗涂(通常为W扣1/min的流动速率的20μ1 的五次洗涂)直到获得稳定基线。
[0200] 纯化的抗GD2单克隆抗体（5F11)在分析之前稀释于改变浓度（50到leOOnM)的含 250mM化C1的皿S-E缓冲液中。样品（6化1)经2分钟W30yl/min的流动速率在感测器表面上 方注射。在完成缔合阶段之后，在含250mM化C1的皿S-E缓冲液中持续300秒在相同流动速 率下监测解离。在每一循环结束时，表面使用经一分钟的50μ1/π?η的流动速率下的50μ1 20mM NaOH和经两分钟的50μ1/π?η的流动速率下的100μΙ 4Μ MgCb再生。在固定GD2上方注 射样品之后获得的生物传感器曲线减去在动力学分析之前在固定GM1上方注射的样品的情 况下获得的控制曲线。数据通过二价分析物模型和使用Biacore T-100评估软件的速率常 数的默认参数设定分析。计算缔合速率常数化合)、解离速率常数(k离)和平衡解离常数化D = k离/k合)。表9和图3A阐述根据实例1制得的双特异性融合蛋白的示例性Kd值传感图。纯化双 特异性融合蛋白的额外样品也通过Biacore测试。示例性结果显示于表10和图3B中。
[0201]表8
[0204] 如表8中所示，ELISA结合检定显示GD2XCD3-HDD相对于GD2XCD3双特异性结合蛋 白的GD2结合的6倍增强（也参见图2A和2B的上图）。与杰卡特细胞的结合并非显著不同（参 见图2A和2B的下图）dGD2结合的Biacore分析（图3A和3B;和表9和10)证实与肿瘤标祀GD2的 巧化倍的亲和力增强。
[02化]在类似实验中，如上文所述地测试化皿T-H孤(SEQ ID NO: 11)的GD2结合。结果显 示于表11和图7中。结果证实如本文所述，3LHBT-H孤显示基于GD2结合的较好活性。确切地 说，3LHBT-H孤展示比3LHBT低约2.5倍的ECso。
[0206] 表11
[0207]
[0208] 结合在一起，运些数据展示人类HNF-化的二聚化组分有效地诱发单链双特异性抗 体二聚化W形成同型二聚体，其和促进与双特异性抗体的抗原中的一个(例如肿瘤抗原）的 功能亲和力。
[0209] 实例3.肿瘤细胞的体外T细胞介导的细胞杀死
[0210] 此实例表明双特异性同型二聚体起始通过T细胞介导的肿瘤细胞杀死的强化的能 力。通常，结合T细胞的双特异性结合蛋白能够将T细胞导引到进行肿瘤的T细胞介导的杀死 的肿瘤位点。在此实例中，显示示例性双特异性同型二聚体比双特异性单链蛋白质更有效 地有效介导肿瘤细胞的T细胞杀死。 铭51(日1化)释放检定
[0212] 黑素瘤和神经母细胞瘤细胞（51(]\^1^、醒8-7、]\114、肥（1化、肌863、册24、51(^〔2、 SKMEL28、册9、化96和H345)在5%0)2含湿气培育箱中在37°C下在补充有10%FBS(生命技术 化ife Technologies))的RPMI1640(Cellgro)中培养。神经母细胞瘤细胞系LAN1和黑素瘤 M14获自洛杉机加州大学(University of California,Los Angeles)eSKNLD开发于纪念斯 隆-凯特琳癌症中屯、（Memorial Sloan Kettering (Mincer Center)eSKLND细胞系衍生自美 国标准菌库(ATCC) IMR-32。验证通过短串联重复(STR)DNA测序进行。
[0213]粘附细胞用1 X抓TA收获。T细胞使用Pan T细胞分离试剂盒根据制造商的说明书 (美天旋生物技术公司（Miltenyi 81〇*6(3))纯化自人类？81(：。〔03八028戴诺珠粒 (dynabead)(茵维特罗根（Invitrogen))用于根据制造商的说明书刺激和扩增T细胞。扩增 的T细胞培养和维持于补充有FBS和30U/mL白介素 -2(比-2)的RPMI中。T细胞群体通过使用 FACSARIA?的流动式细胞测量术用抗CD3-percep巧5.5、抗CD4-門TC、抗CD8-APC和抗CD56-阳抗体(碧迪生物科学公司(BD Biosciences))进行鉴别和分析。
[0214] 标祀肿瘤细胞持续一小时在37°C下用每106个细胞lOOyCi的"Cr铭酸钢(伊利诺伊 州阿林顿高地的安玛西亚(Amersham, Ar 1 ington Hei曲t, IL))标记。细胞经洗涂两次。标革己 细胞(每孔5000个细胞)与效应细胞和双特异性融合蛋白在96孔聚苯乙締圆底板(碧迪生物 科学公司）中渗和到每孔25化1的最终体积。板在37°C下培育四小时且随后在400g下离屯、五 分钟。上清液中的S1化释放在伽码计数器(gama counter)(伊利诺伊州唐纳斯格罗夫的填充