抗cd20的全人源单克隆抗体及其应用

抗cd20的全人源单克隆抗体及其应用
【专利说明】
[0001] 本申请是分案申请，其原申请的申请号为201210082298. 6,申请日为2012年3月 26日，发明名称为"抗CD20的全人源单克隆抗体及其应用"。
技术领域
[0002] 本发明设及抗体药物的技术领域。具体地说，设及一组全人源单克隆抗体新分子， 其可用于淋己瘤的诊断和治疗。
【背景技术】
[0003] 1.CD20
[0004] CD20是一种分子量为33~37kDa的非糖基化磯蛋白，有4个跨膜区，氨基端和駿 基端都位于细胞质膜内侧，在第=跨膜区和第四跨膜区之间，有一个由43个氨基酸残基组 成的环区，构成其主要的抗原表位。作为B淋己细胞表面分化抗原，它起始表达于pre-B细 胞阶段，到B细胞终端分化成浆细胞时结束，一直被认为是B系细胞表面特有的标识。它主 要参与调节B淋己细胞的增殖与分化，在免疫系统起重要作用。80%~85%的非霍奇金氏 淋己瘤（饥正）为B细胞来源，并且该些细胞的约95%均有表面CD20表达CD20的表达 因淋己瘤细胞的不同而有所差异，滤泡性淋己瘤细胞表面表达较高，小细胞淋己瘤白血病 细胞表面表达较低，在干细胞和浆细胞中不表达，慢性B淋己白血病细胞中的表达远低于 正常的B细胞和其他B淋己瘤细胞，CD20的表达高低在一定程度上决定了抗体和补体杀伤 瘤细胞的程度?。单核细胞、静息W及激活的T细胞、裸细胞W及非淋己细胞都不表达CD20 分子。CD20与抗CD20抗体结合后内化现象不明显，细胞表面CD20分子数量并不因为与抗 体结合而大量减少，CD20也不会发生明显细胞表面脱落的现象，因此，CD20是免疫治疗B细 胞淋己瘤的理想作用位点，特别是对治疗惰性、复发难治性B细胞淋己瘤有较肯定的疗效。
[0005] 2.治疗性抗CD20抗体
[0006] 抗CD20治疗可清除恶性B细胞和部分正常B细胞，但由于干细胞和B细胞前体不 表达CD20,因而不会造成长期B细胞损耗。其临床应用主要适应证为；1.单纯应用抗CD20 单克隆抗体治疗滤泡性B细胞型非霍奇金淋己瘤；2.抗CD20单克隆抗体与化疗联合应用 治疗弥漫大B细胞型淋己瘤及慢性B淋己细胞白血病炬-化L)。
[0007]2. 1I?i1:uximab(美罗华）
[0008]IDEC-C2B8,又名化化ximab，商品名为美罗华，1997年由抑A批准上市，是第一个 被美国FDA批准用于治疗肿瘤的单克隆抗体W。它是一个人鼠嵌合抗体，包含鼠源抗CD20 单克隆抗体2B8(Ibritumom油）的可变区和人源IgGl重链及K链的恒定区，用于B细胞淋 己瘤的治疗。Rituximab在体内通过抑制细胞增殖或触发多种细胞破坏机制，包括抗体依赖 性细胞毒作用（ADCC)和补体依赖性细胞毒作用（CDC)W及细胞调亡发挥明显的抗肿瘤功 效W。近年的临床研究证实，该药治疗谱较广，对B淋己细胞性疾病均可取得较好的疗效。
[0009] 2. 2ZEVALIN
[0010] 2002年2月，抑A批准了第一个放射性免疫治疗药物Zevalin。该药由IDEC制药 公司生产，通用名扣ritumom油Tiuxetan。FDA批准此药用于治疗复发性或难治性低恶性 度/滤泡性或转化的B细胞饥正，其中包括化tuximab难治性的滤泡性NHL。该产品由小鼠 IgGl-K单克隆抗体2B8abritumomab)连接同位素9°Y用于肿瘤治疗。其单抗部分对CD20 具有高的特异亲和性W。
[00"] 2. 3 邸XXAR
[0012] 2003 年 6 月 27 日，FDA批准Bexxar(Tositumom油和nijTositumom油）用于治疗 癌细胞已经或未发生转移、对化化ximab有耐药性、化疗后又复发的CD20阳性滤泡性饥正。 它由鼠源单克隆抗体一抗B1单克隆抗体（Tositumomab，IgG2a-A)与放射性同位素"4共 价偶联而成。
[0013] 2. 4ARZERA
[0014] 2009年10月26日，FDA批准ARZERA(Ofatumum油）用于治疗慢性淋己细胞性白血 病（化L)。它由KM人源转基因鼠免疫通过杂交瘤技术产生的人单克隆抗体。和化化ximab 相似其在体内通过抑制细胞增殖或触发多种细胞破坏机制，包括抗体依赖性细胞毒作用 (ADCC)和补体依赖性细胞毒作用（CDC)W及细胞调亡发挥明显的抗肿瘤功效。但其在治疗 非霍奇金氏淋己瘤（NHL)的S期临床试验失败。目前其主要用于对一线化疗药物耐受的慢 性淋己细胞性白血病。
[0015] 3.化化ximab在临床的应用
[0016] 3. 1单独应用治疗非霍奇金氏淋己瘤（NHL)
[0017] 化化ximab可单独应用，推荐的使用剂量是每周375毫克/平方米，静脉内注射， 共4次，治疗复发或耐药性低度恶性CD20阳性B细胞NHL;II期临床试验表明，总体有效率 为48%，其中6%为完全有效，42%为部分有效，缓解期通常为1年。对于初治的低度恶性 饥正，单药有效率为50%~70%左右，维持治疗能够进一步提高疗效。副作用较温和，可随 抗体输入量的减少而减轻，治疗中没有或少有感染并发症发生。因而化化xim油作为一线 药物应用治疗饥正已有着无法替代的作用。
[0018] 2004年，欧盟许可化化xim油联合标准化疗W治疗侵袭性饥正。一些临床试验用 来评估化化xim油单独或联合治疗惰性、侵袭性饥正和其他一些B细胞淋己组织增生素乱。 化tuxim油对类风湿性关节炎、免疫性血小板减少性紫藏、免疫性溶血性贫血、系统性红斑 狼疮和多发性硬化等自身免疫素乱性疾病的作用也在研究中W。
[0019] 3. 2联合化疗治疗B细胞淋己瘤
[0020] 徐志巧等W应用同期对照的前瞻性研究方法，将22例B细胞性饥正患者分为研 究组巧ituxim油组）和对照组，研究组11例用CHOP方案（环磯酷胺、多柔比星、长春新碱 和泼巧松）联合化化xim油治疗；对照组11例单用CHOP方案。结果化化xim油组完全缓 解率（CR)达72. 7%巧/II)，总有效率90. 9% (10/11);对照组CR为36. 4% (4/11)，总有 效率为54. 6% (6/11)，两组疗效差异有统计学意义。初步研究结果提示，化化xim油联合 CHOP方案治疗CD20阳性的B细胞性饥正的疗效显著，不良反应与单纯化疗相似，可作为该 病目前的首选方案。
[0021] 3. 3在风湿性疾病治疗中的应用
[0022] 类风湿关节炎（rheumatoidart虹itis，RA)是一种W滑膜炎为主要病理改变的全 身性自身免疫病，W慢性破坏性关节病变为特征。B细胞是类风湿因子（RF)、抗瓜氨酸抗体 (抗CCP)等自身抗体的主要来源细胞，同时研究表明RA滑膜中T细胞活化主要依赖于B细 胞抗原呈递作用?，是RA等自身免疫病发病机制核屯、环节之一。
[0023] Edwards等nw报道了161例大样本的随机双盲对照研究，试验分为口服甲氨蝶 岭组（>lOmg/ 周）、I?i1:uximab组（Igdl，dl5)、I?i1:uximab联用环磯酷胺组（750mgd3， dl7)、化化ximab联用甲氨蝶岭组，结果显示，化化xim油治疗组24周后达到ACR2065%~ 76%，单用甲氨蝶岭治疗组为38%，两者比较有显著性差异（P<0. 025);持续观察48周， 化化xim油治疗组疗效（ACR2033%~65% )与单用甲胺蝶岭组（ACR2020% )相比仍有显 著性差异（P《〇. 01)。在治疗第24周达AC贴0缓解的患者，单用化化xim油组（33%)、联用 甲氨蝶岭组（43%)、联用环磯酷胺组（41%)均高于甲氨蝶岭组（13%)。此外，Rituximab 治疗组患者的RF水平迅速下降。且24周内维持较低水平。而单用甲氨噪岭组RF水平仅 一过性轻度下降。该试验化化ximab疗效与B细胞清除情况相关，证明了化化ximab在RA 中的治疗作用W及B细胞在RA发病中的重要作用。针对化化xim油对RA的治疗作用的一 系列研究也表明化化xim油治疗RA疗效稳定，是生物治疗的新途径。
[0024] 3. 4对系统性红斑狼疮的治疗作用
[0025] 系统性红斑狼疮（systemiclupuse巧thematosus,SLE)是多系统受累、W多种自 身抗体表达的自身免疫性疾病。B细胞在SLE发病机制中发挥了关键性作用；分泌大量致 病性自身抗体和白介素10 (比-10)、白介素6 (IL-6)、肿瘤坏死因子（TNF-丫）等多种细胞因 子；高选择性的抗原呈递作用，将抗原呈递给T细胞，同时刺激调节T细胞、树突状细胞活化
[11] 〇
[0026]Loon巧等哉道了 17例化化xim油治疗SLE的I/II期扩大临床试验，均为 活动性狼疮。大部分患者同时接受免疫抑制剂治疗。分为=组接受低、中、高不同剂量的 化化ximab，分别为100mg/m2、275mg/m2、375mg/m2每周1次、共4周。结果表明疾病控制与B 细胞清除情况有关。11例B细胞清除（CD19阳性细胞巧M)患者皮疹、发热、关节痛等临 床症状可缓解。系统性红斑狼疮活动评分（SLAM)多在用药2~3个月时缓解，持续12个 月。
[0027] 初步临床研究证明化化xim油治疗SLE是可行的，其疗效和安全性期待大样本临 床研究。
[0028] 3. 5化化xim油治疗小儿免疫性血小板减少性紫藏
[0029]免疫性血小板减少性紫藏（immunologict虹omboc}ftopenicpu;rpura，口巧是一 种自身免疫性出血性疾病。目前研究证明，ITP患者T淋己细胞调节素乱，导致B淋己细胞 功能素乱，产生针对自身血小板的IgG抗体，进而使血小板破坏增多。文献报道化化ximab 可快速持久地清除循环中的B淋己细胞，减少自身抗体的产生，从而减少血小板的破坏。 Taube等叫吏用化化xim油治疗了 22例慢性ITP患儿，在化化xim油用后的1~2周外周 血CD20阳性B淋己细胞呈明显下降，2~3个月后逐渐恢复正常。结果7例完全缓解，6例 部分缓解，5例复发，反应率为59% (13/22)，复发率为38%巧/13)，持续缓解的时间是2~ 16个月。石淑文等M用化化xim油治疗了 3例小儿慢性/难治性口P，3例均为联合用 药，1例联合阿赛松治疗部分缓解，治疗后患儿血小板持续维持相对较高的水平达18个月 之久，且不再需要IVIG冲击治疗，阿赛松逐渐减量至停用，余两例分别联合了大剂量IVIG、 班巧酸氨化考的松和长春新碱，治疗后血小板有短暂的回升（分别是21天和11天），但很 快又降至同入院前的低水平且持续不见回升，认为短暂的血小板回升可能是大剂量IVIG、 班巧酸氨化考的松或长春新碱的作用，为不缓解病例。上述结果表明化tuxim油对ITP有 较好的治疗作用，能够快速持久地清除循环中的B淋己细胞，减少自身抗体的产生，从而减 少血小板的破坏，可作为临床用药。但部分病例该种清除是暂时的，停用化化xim油后循 环中的B淋己细胞又会恢复，该可能和部分病人再次复发有关。关于化化xim油治疗慢性 /难治性ITP的总反应率成人为23~75 % ^53，儿童为66 %，基本相同。
[0030] 4.人源抗体的制备
[0031] 20世纪70年代中期杂交瘤技术问世，由此制备出的单克隆抗体（MAb)是抗单一抗 原决定簇的抗体，具有高度的特异性和均一性，且能大量制备，该成为抗体研究领域的一次 重大革命。1986年，应用此技术制备的第一个单克隆抗体药物OKT3被美国抑A批准上市， 被用于治疗器官移植后的免疫排斥。但由于抗体是鼠源的，在病人中引发了严重的免疫反 应，该就大大阻碍了抗体药物的发展和利用。
[0032] 随着抗体被用来开发成药物，它的一些特征也将被严格考量，像免疫原性、亲和 力、稳定性、效应功能、半衰期、组织渗透性及其分布等bu。在鼠源MAb生产变得成熟时，研 究者便预想通过常规的杂交瘤技术生产人源MAb，但由于人杂交瘤细胞系不能稳定的生产 高产量的抗体，并且对于很多抗原来说，人的体内免疫是不可行的。该样，基因工程抗体由 然而生，1994年，第一个嵌合抗体ReoPro获准上市，临床应用表明其免疫原性远优于鼠源 抗体，该就掀起了继杂交瘤单克隆抗体之后抗体工程研究领域的又一次革命。特别是90年 代中期W来，为进一步降低免疫反应的发生，多种人源化改造技术被成功开发并得W应用， 各种各样的基因工程抗体及抗体库不断出现使得大规模生产医用人源化抗体成为 可能。从1997年开始，大批的单抗药物被抑A批准上市。
[0033] 单抗人源化改造技术的应用打破了抗体药物产业化的瓶颈。迄今，按照人源化 程度的高低大体可分为=种技术：嵌合、人源化和全人源，其基因中人源序列占比分别为 75%、95%和100% 其中嵌合抗体是将鼠杂交瘤单克隆抗体基因的可变区和人的恒定 区连接在一起，然后在哺乳动物细胞中进行表达产生；而人源化抗体则是除了将抗体的恒 定区换成人源的之外，更进一步的将可变区的FR区转换成人源的bw，从而降低免疫原性； 而全人源抗体制备则是有四种途径，一种从采集的