病人血样中构建F油或者ScFv文库，并 通过瞻菌体展示筛选抗体库，来产生人源MAbW。2002年，第一个全人源MAb，Humira，就是 通过瞻菌体展示开发出来的。第二种生产人源抗体的策略是用含有人免疫球蛋白基因位点 的转基因小鼠，进行免疫，可W产生人抗体的免疫应答，该样通过传统的杂交瘤技术可W来 生产人源MAb^，从转基因小鼠衍生而来的人源MAb正在临床试验中。第=种途径是通过分 离培养人外周血淋己细胞或扁桃体淋己细胞，然后用抗原进行免疫刺激，产生免疫应答，然 后再和人类骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤细胞，经筛选得到人源单克隆抗体，并立即进行分 子克隆抗体基因，使用其他可长期稳定表达的哺乳动物细胞来表达目的抗体，该种抗体完 全是在人细胞环境中生成的。第四类途径是通过分离和低密度（约500B细胞每96孔）培 养人外周血淋己细胞或扁桃体淋己细胞，对培养上清进行抗原特异性筛选，对阳性孔B细 胞进行分子克隆获得人抗体基因，再使用其他可长期稳定表达的哺乳动物细胞来表达目的 抗体。
[0034] 本发明的全人源单克隆抗体就是基于上述第=种途径并加W随机突变筛选得来 的。利用人-人杂交瘤产生的单克隆抗体被认为是在氨基酸序列和糖基化谱上都要优于嵌 合抗体和人源化抗体的全人源抗体。但是由于难W找到使人-人杂交瘤稳定传代的融合伴 侣细胞，且由于融合效率低、细胞培养困难及生产能力低等问题，制备稳定传代且能持续产 生单克隆抗体的人-人杂交瘤细胞系一直存在较大难度，且成功的实例甚少。本发明对表 达人抗体的人-人杂交瘤快速进行包括特异性和功能学在内的筛选，并将筛选出的杂交瘤 细胞进行分子克隆化W保存抗体基因，从而克服了上述困难。
[0035] 随着人源化和全人源抗体技术的成熟，如何提高抗体的亲和力成了目前所有基因 工程抗体药物需要解决的关键问题。该是因为增加一个抗体的亲和力将降低抗体药物的剂 量并起到更好的生物活性，还可能使其治疗更多的疾病及降低剂量相关的毒性此 夕F，费用也将大大降低。多项独立的研究表明，抗体亲和力和生物学活性在达到极限值之前 是成线性关系的。围绕该一问题人们已经从不同的方向展开了研究，提高抗体亲和力的途 径基本有两条途径，其中一个途径是通过随机突变CDR或是整个的VR，然后从该个大量的 突变体库里筛选更高亲和力的抗体W;另一个途径是通过集中突变或是建模模拟体内亲 和力成熟的热点区域，建立一个小的突变体库Mtw。综合起来说，当进行体外抗体亲和力 成熟时，应考虑4个主要方面；①在抗体基因的何处导人突变；②如何导入突变；⑨如何从 较低亲和力的抗体中选择稀有的更高亲和力抗体。④如何鉴别更高亲和力抗体。
[0036] 目前已批准上市的S种针对CD20的抗体均为Biogen-Idec公司创制。其中 Zevalin和Bexxar为鼠源单抗，并且主要是通过抗体介导放射性同位素到肿瘤部分，发挥 放射性细胞毒直接杀伤肿瘤细胞。由于放射毒性和人抗鼠抗体的产生等因素，导致临床疗 效不佳，适应症狭窄。Rituxan(即化化ximab)系人鼠嵌合型抗CD20单克隆抗体，其可通过 CDC、ADCC、诱导CD20细胞发生调亡或直接抑制恶性B细胞的增殖来发挥其治疗效果且都获 得了很好的疗效。但是由于其25%鼠源部分，更容易产生鼠源性免疫原性，即人抗鼠抗体 反应。该将会引起较多的输液反应，同时也无法长期用药。因为在病人血清中循环的人抗 鼠抗体将会中和Rituxan而使其疗效下降甚至失效。此外Rituxan本身杀瘤疗效还存在着 提高的空间，例如其目前临床有效率（CR+PR)约为50%，不能连续用药，而且缓解期只有一 年，因此有必要发明新的抗体分子来提升此类药物的疗效本发明正是针对化化ximab 不足之处而进行的新分子创制；（1)变鼠人嵌合抗体为全人源抗体（2)通过新药物的提升， 使其针对其他瘤细胞的CDC，ADCC和调亡能力增强W提高杀瘤疗效。
【发明内容】
[0037] 本发明提供抗CD20的一组新抗体，该些抗体为全人源抗体，并且作为一种新药 物，该些抗体的多项CD20特异性的细胞毒功效比美国同类药物美罗华强，具有比美罗华相 同或更好的药效。可用于治疗和诊断非霍奇金氏淋己瘤、B细胞淋己瘤、风湿性和类风湿性 疾病、系统性红斑狼疮、免疫性血小板减少性紫藏和/或多发性硬化症等疾病。
[003引本发明的抗体的重链恒定区为人IgGl重链的恒定区，轻链恒定区为人K链的恒 定区，重链可变区的氨基酸序列为SeqIDN0:l、SeqIDN0:2、SeqIDN0:3和SeqIDN0:4 中的一个，轻链可变区的氨基酸序列为SeqIDN0:5、SeqIDN0:6、SeqIDN0:7和SeqID NO:8中的一个。
[0039]其中优选10种抗体，其重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别为：
[0040]
[0041]
[0042] 本领域技术人员将知晓的是，上述抗体中的保守性氨基酸替换并不会实质性地影 响抗体的亲和力和结构，尤其是所述保守性替换发生在恒定区时。本领域技术人员还知晓， 根据上述抗体的氨基酸序列可W设计出编码其的核巧酸序列，并且针对不同的表达宿主对 该核巧酸序列进行优化。为了治疗、检测、实验或其他目的，本发明的抗体可W与同位素、免 疫毒素和/或化学药物共价连接，还可W与固体介质、半固体介质偶联，还可W使用本发明 的抗体的功能性片段，该在本领域中是已知的。
[0043] 本发明提供了一种方法，使用该方法制造全人源抗体并且作为一种新药物。目前 尚未有抗体药物系使用本发明的技术方法成功创制的报道。该方法所克服的最重要的技术 难点是（1)人淋己细胞体外有效免疫技术；（2)人杂交瘤基因不稳定，必须快速进行包括特 异性和功能学在内的筛选，并将筛选出的杂交瘤细胞进行分子克隆化W保存抗体基因；（3) 对已筛选出具有一定药理学功效的人源抗体通过分子生物学抗体工程技术进行进一步优 化改造。
[0044] 所述抗体的制造及相关检测方法如下；通过提取不同人的外周血淋己细胞或者是 人扁桃体淋己细胞，体外混合后，用抗原和具有佐剂功用的分子共培养，使其产生针对抗原 的抗体，通过与骨髓瘤细胞融合，产生临时稳定的人杂交瘤，培养上清中含有其分泌的人源 抗体。通过细胞ELISA(CD20阳性细胞和CD20阴性细胞双筛选）筛选出CD20阳性杂交瘤 细胞生长孔，再W相对抗原亲和力，细胞毒功能测试（ADCCXDC和调亡实验）综合评估筛选 最好的10个细胞生长孔，并立即进行亚克隆，筛选出保持抗原特异性的单克隆细胞株。立 即进行测序和分子克隆抗体基因到适当的表达载体中，并将质粒DNA扩增纯化于-80°C永 久保存。根据相对抗原亲和力，细胞毒功能测试（ADCC、CDC和调亡实验）综合评估筛选最 好的3个单克隆细胞株的抗体基因，W此作为模板对其进行体外抗体亲和力成熟工程。我 们W对CDR1、CDR2、CDR3区进行随机突变和定点突变相结合的方式建立抗体亲和力成熟突 变文库。W抗原特异性和相对亲和力排序对文库进行筛选。将每轮最好的5~10抗体的 重链可变区（Vh)和轻链可变区（Vl)进行全排列组合形成全长抗体。使用瞬转、培养和微量 亲和纯化（ProteinA)制备少量纯化抗体，W细胞毒功能测试（ADCC、CDC和调亡实验）进 行筛选鉴定。在经此筛选出来的一组有良好细胞毒功效的抗体分子，再对该些抗体可变区 特别是CDR区序列检索，确定此组具备CD20特异性的细胞毒功效的抗体为首次发现的新分 子。在此组新分子里有一个或一个W上的新抗体分子其（1)多项CD20特异性的细胞毒功 效比美罗华强；（2)皮下移植瘤和生存期的试验结果显示其具有比美国同类药物美罗华相 同和更好的药效。
[0045] 在确定本发明的抗体的氨基酸序列后，可W通过人工合成编码该抗体的多核巧酸 并选取适合的宿主进行有效地表达来制备该抗体，该在本领域中是公知的。
[0046] 除非特别说明，在本文中"化Uixan"、"化Uiximab"和"美罗华"可W互换使用。
【附图说明】
[0047] 图1~图3为Raji细胞CDC测试结果；其中图1是对不同人杂交瘤上清液的CDC 功能学筛选；图2是对亲和力成熟后CH0细胞表达纯化人抗体肥L3、肥L6、肥L10、服L3和 服L10的CDC功能学筛选；图3是对亲和力成熟后CH0细胞表达纯化人抗体服L15、化1L6、 H11L10、H19L3和H1化15的CDC功能学筛选；
[0048] 图4~图6为Raji细胞ADCC测试结果；其中图4是对不同的人杂交瘤上清液 的ADCC功能学筛选；图5是对亲和力成熟后CH0细胞表达纯化人抗体肥L3、肥L6、肥L10、 服L3和服L10的ADCC功能学筛选；图6是对亲和力成熟后CH0细胞表达纯化人抗体服L15、 H11L6、H11L10、H19L3 和H1 化 15 的ADCC功能学筛选；
[0049] 图7.源自细胞株1. 105. 3的重链经突变得到的化~肥0根据亲和力的排序；图 8.源自细胞株1. 105. 3的轻链经突变得到的L1~L20根据亲和力的排序；对应的结果数 据和Kd值参见表6 ;
[0化0] 图9.经筛选的重链突变基因和轻链突变基因组合的根据亲和力的排序；对应的 结果数据和Kd值参见表7 ;
[0化1] 图10显示了抗体肥L10治疗人B细胞淋己瘤的小鼠Raji细胞侵润瘤模型的药效 学试验结果，是对小鼠体重和健康状态的观察。静脉注射l〇7Raji淋己瘤细胞形成小鼠淋己 瘤疾病模型。分五组分别为1.生理盐水组、2.美罗华组、3.肥L10(即本发明的代表性抗 体）低剂量组、4.肥L10中剂量组和5.肥L10高剂量组。癌细胞静脉注射后7天开始给药。 腹腔注射每周一次。图中为各组动物体重变化。生理盐水组动物自第16天后开始明显下 降并呈肿瘤恶液质。美罗华组在第37天开始出现体重明显下降，总体呈亚健康状态直至第 50天试验结束。而肥L10高中低=组动物均呈健康状态，体重正常增长。此结果清楚表明 肥L10和美罗华均对淋己瘤动物有肯定的疗效，肥L10各组包括低剂量组疗效均优于美罗 华。
[0化2] 图11显示了抗体肥L10治疗人B细胞淋己瘤的小鼠Raji细胞侵润瘤模型的生存 期试验结果。静脉注射l〇7Raji淋己瘤细胞形成小鼠侵润型淋己瘤疾病模型。分五组分别 为1.生理盐水组、2.美罗华组、3.肥L10低剂量组、4.肥L10中剂量组和5.肥L10高剂量组。 癌细胞静脉注射后7天开始给药。腹腔注射每周一次。生理盐水组动物自第23天开始明 出现死亡，到第34天全部死亡。美罗华组和肥L10高中低S组动物均无死亡直至第50天 试验结束。但美罗华组在第37天开始出现体重明显下降，并总体呈亚健康情况直至50天 试验结束。此结果清楚表明肥L10和美罗华均可肯定地延长淋己瘤动物的生存时间。
[0053] 图12显示了抗体肥L10治疗人B细胞淋己瘤小鼠raji细胞原位移植瘤抑瘤实验 结果。小鼠接种后观察肿瘤生长情况，待肿瘤体积为40-100皿3左右时，按瘤体积大小进行 筛选，瘤体积过大及未成瘤者不予入选。筛选后随机分为3组；1.生理盐水组、2.美罗华 组、3.肥L10。给药剂量5mg/kg，腹腔注射每周一次。试验结果清楚表明美罗华和肥L10均 可W明显抑制Raji细胞皮下移植瘤的生长，肥L10药效和美罗华有同等药效。
【具体实施方式】
[0054] 下文将通过具体的实施例来阐明本发明，但应理解的是，W下实施例并不限制本 发明的范围。
[0055] 实施例
[0056] 实施例1 ;杂交瘤和载体的制备
[0化7] 1.杭原巧淋产，细胸的准各及免巧
[005引 1. 1抗原准备：
[0化9] 1.1. 1CD20蛋白
[0060] 购买人CD20(Novusbio)抗原，用PBS稀释后，用0. 22ym针式无菌滤器过滤。
[0061] 1. 1. 2表达CD20膜蛋白的293F细胞的制备
[0062]购买CD20 的cDNA(Origene，SC101205)，并设计、合成PCR扩增引物；
[0063]CD20 正向引物；5' -TCAGGAGTTTTGAGAGCAAAATG-3'
[0064]CD20 反向引物；5, -AACAGAAGAAATCACTTAAGGAG-3，
[00化]然后WCD20的cDNA为模板进行扩增、纯化，并克隆到pCR3. 1载体（Invitrogen，K300001)中，测序验证后，大量制备该质粒，然后按照说明书转染化eeStyle?293-F细胞 (Invitrogen，R790-07)，48 小时后，加入Img/ml的G418 (Invitrogen，10131035)培养 2 周， 稳定的G418抗性克隆被筛选出来，并冻存。
[0066] 1. 1.3抽提的CD20膜蛋白
[0067] 使用细胞膜蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒（购自碧云天生物研究所）由 CD20-293F细胞依循试剂盒说明书抽提CD20膜蛋白。用0. 22微米滤器过滤后分装于1. 5 毫升细胞冻存管-80°C保存。
[0068] 1. 2人淋己细胞准备；
[0069] 无菌摘取慢性扁桃体炎新鲜组织样本（与徐州医学院附院