植物调控元件及其用图
【专利说明】植物调控元件及其用途
[oocn] 相关申请的引用
[0002] 本申请要求于2012年12月19日提交的美国临时申请序列号61/739, 720的权益， 所述美国临时申请W引用方式整体并入本文中。
[000引序列表的并入
[0004] 包含在文件名为"M0NS323W0seq.txt"的文件中的序列表在此W电子递送方式提 交并且W引用方式并入本文中，所述文件为345邸（按照MicrosoftWindows⑩中所测 得）并且于2013年12月17日创建。 发明领域
[0005] 本发明设及植物分子生物学、植物遗传工程W及可用于调节植物中基因表达的 DNA分子的领域。
[000引发明背景
[0007] 调控元件是通过调节可操作地连接的可转录DNA分子的转录来调控基因活性的 遗传元件。该样的元件包括启动子、前导序列、增强子、内含子和3'非翻译区，并且可用于 植物分子生物学和植物遗传工程的领域中。
[000引发明概述
[0009] 本发明提供用于植物中的新颖基因调控元件和包含所述调控元件的构建体。本发 明还提供包含所述调控元件的转基因植物细胞、植物、植物部分和种子。在一个实施方案 中，本发明提供本文所公开的可操作地连接至可转录DNA分子的调控元件。在某些实施方 案中，可转录DNA分子相对于本文所提供的调控元件序列是异源的。本文还提供制备和使 用本文所公开的调控元件、包含所述调控元件的构建体W及转基因植物、植物细胞、植物部 分和种子的方法，所述转基因植物、植物细胞、植物部分和种子包含可操作地连接至相对于 所述调控元件为异源的可转录DNA分子的调控元件。
[0010] 因此，在一个方面，本发明提供包含DNA序列的重组DNA分子，所述DNA序列选自 由W下组成的组；a)与SEQIDNO: 1-98和168-171中任一个具有至少约85%序列同一性的 DNA序列；b)包含SEQIDNO: 1-98 和 168-171 中任一个的DNA序列；和C)SEQIDNO: 1-98 和168-171中任一个的片段，其中所述片段具有基因调控活性；其中所述DNA序列可操作 地连接至异源可转录DNA分子。"异源可转录DNA分子"意指可转录DNA分子相对于DNA 序列是异源的。在特定实施方案中，重组DNA分子包含与SEQIDNO: 1-98和168-171中任 一个的DNA序列具有至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少约95%、 至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的DNA序列。在具体实施方案中， 异源可转录DNA分子包含农学目的基因，例如能够在植物中赋予除草剂抗性或抗虫性的基 因。在另外其它实施方案中，本发明提供包含如本文所提供的重组DNA分子的构建体。
[0011] 在另一方面，本文提供包含重组DNA分子的转基因植物细胞，所述重组DNA分子包 含选自由W下组成的组的DNA序列；a)与SEQIDNO: 1-98和168-171中任一个具有至少 约85%序列同一性的DNA序列；b)包含SEQIDNO: 1-98和168-171中任一个的DNA序列； 和c)SEQIDN0:l-98和168-171中任一个的片段，其中所述片段具有基因调控活性；其中 所述DNA序列可操作地连接至异源可转录DNA分子。在某些实施方案中，转基因植物细胞 是单子叶植物细胞。在其它实施方案中，转基因植物细胞是双子叶植物细胞。
[0012] 在又一方面，本文进一步提供包含重组DNA分子的转基因植物或其部分，所述重 组DNA分子包含选自由W下组成的组的DNA序列；a)与SEQIDNO: 1-98和168-171中任 一个具有至少约85%序列同一性的DNA序列；b)包含SEQIDNO: 1-98和168-171中任一 个的DNA序列；和c)SEQIDNO: 1-98和168-171中任一个的片段，其中所述片段具有基因 调控活性；其中所述DNA序列可操作地连接至异源可转录DNA分子。在特定实施方案中，转 基因植物是相对于起始转基因植物，任一代的子代植物，并且包含重组DNA分子。本发明还 提供包含重组DNA分子的转基因种子，其在生长时产生所述转基因植物。
[0013] 在又一方面，本发明提供通过W下方式在转基因植物中表达可转录DNA分子（例 如农学目的基因）的方法：获得含有本发明的重组DNA分子的转基因植物并且栽培所述植 物。
[0014] 本文还提供了通过W下方式提供转基因植物的方法：用本发明的重组DNA分子转 化植物细胞W产生转化的植物细胞并且使所述转化的植物细胞再生W产生转基因植物。
[0015] 附图简述
[0016] 图1;显示对应于来自云草（Agrostisnebulosa)的启动子元件的各种大小的 多个启动子变体的比对。具体地说，图1显示包含在调控表达元件组巧XP化XP-AG化e. 化ql:l:7(SEQIDN0:1)中的 2005 碱基对化P)启动子P-AG化e.化ql-l:l:5(SEQID N0:2)与P-AGRne.Ubql-l:l:5 的启动子变体的比对。例如P-AGRne.Ubql-l:l:5 的 5,端 的缺失产生启动子P-AG化e.化ql-l:l:4(SEQIDN0:6)，所述启动子是包含在EXP-AG化e. 化ql:l:8(SEQIDN0:5)中的999bp序列。示于图1中的另一启动子变体是P-AG化e. 化ql-l:l:6(SEQIDN0:8)，其为包含在EXP-AG化e.化ql:l:9(SEQIDN0:7)中的 762bp序 列。
[0017] 图2;显示对应于来自芦竹（Arundodonax)的启动子元件的各种大小的多个启动 子变体的比对。具体地说，图2显示包含在调控表达元件组EXP-ARUdo.化ql: 1:4(SEQID N0:9)中的 4114bp启动子P-ARUdo.化ql-l:l:4(SEQIDN0:10)与P-ARUdo.化ql-l:l:4 的启动子变体的比对。所述比对中包括2012bp启动子P-ARUdo.化ql-l:l:5(SEQID N0:14) ;1000bp启动子P-ARUdo.Ubql-1:1:6(SEQIDN0:17);和 75化p启动子P-ARUdo. 化ql-l:l:8(SEQIDN0:22)。
[0018] 图3;显示对应于来自芦竹的启动子元件的各种大小的多个启动子变体的 比对。具体地说，图3显示2033bp启动子P-ARUdo.化q2-l: 1:4(SEQIDN0:24)与 P-ARUdo.化q2-l: 1:4的启动子变体的比对。所述比对中包括2004bp启动子P-ARUdo. 化q2-l:l:6(SEQIDN0:28) ;100化口启动子P-ARUdo.化q2-l:l:5(沈QIDN0:31);和69化P 启动子P-ARUdo.化q2-l:l:7(SEQIDN0:33)。
[0019] 图4;显示对应于来自格兰马草炬outeloua gracilis)的启动子元件的各种大小 的多个启动子变体的比对。具体地说，图4显示237化P启动子P-B0U gr.化ql-l:l:2(SEQ ID N0:35)与P-BOUgr.化ql-l:l:2的5'端的启动子变体的比对。所述比对中包括1999bp 启动子P-BOUgr.化ql-l:l:3(SEQ ID N0:39) ;1022bp启动子P-BOUgr.化ql-l:l:5(SEQ ID N0:42);和 760bp启动子P-BOUgr.化ql-l:l:6(SEQIDN0:44)。
[0020] 图5 ;显示对应于来自格兰马草的启动子元件的各种大小的多个启动子变体的 比对。具体地说，图5显示2100bp启动子元件P-BOUgr.化q2-l:l:4(SEQIDN0:46)与 P-BOUgr.化q2-l: 1:4的启动子变体的比对。所述比对中包括2043bp启动子P-BOUgr. 化q2-l:l:7(SEQIDN0:50) ;2002bp启动子P-BOUgr.化q2-l:l:5(SEQIDN0:53) ;1024bp 启动子P-BOUgr.化q2-l:l:6(SEQIDN0:56);和 749bp启动子P-BOUgr.化q2-l:l:8(SEQ IDN0:61)。
[0021] 图6;显示对应于来自中国芒（Miscanthussinesis)的启动子元件的各种大小的 多个启动子变体的比对。具体地说，图6显示5359bp启动子元件P-MISsi.化ql-1:1:2(SEQ IDN0:63)与P-MISsi.化ql-l:l:2的启动子变体的比对。所述比对中包括2423bp启动 子P-MISsi.化 沈QIDN0:67);1447bp启动子P-MISsi.化ql-l:l:10(沈QID N0:71) ;899bp启动子P-MISsi.化ql-l:l:13(SEQIDN0:73) ;69化p启动子P-MISsi. 化ql-l:l:14(SEQIDN0:75);和 506bp启动子P-MISsi.化ql-l:l:9(SEQIDN0:77)。 [002引 图7 ;显示对应于来自裂释草（Schizachyiumscoparium)的启动子元件的各 种大小的多个启动子变体的比对。具体地说，图7显示283化P启动子元件P-SCHsc. 化ql-l:l:12(SEQIDN0:79)与P-SCHsc.化的启动子变体的比对。所述比对 中包括 2033bp启动子P-SCHsc.化ql-1:1:11(SEQIDNO: 83) ; 1046bp启动子P-SCHsc. 化ql-l:l:10(沈QIDN0:85);和 547bp启动子P-SCHsc.化ql-l:l:14(沈QIDN0:87)。
[0023] 图8;显示对应于来自黄假高梁（Sor曲astrumnutans)的启动子元件的各 种大小的多个启动子变体的比对。具体地说，图8显示2218bp启动子元件P-S(?nu. 化ql-l:l:4(SEQIDN0:89)与P-S0化U.化ql-l:l:4的启动子变体的比对。所述比对 中包括 1964bp启动子P-S0化U.化ql-1:1:5(SEQIDNO: 93) ; 1023bp启动子P-S0化U. 化ql-l:l:6(SEQIDN0:96);和 724bp启动子P-S0化U.化ql-l:l:7(SEQIDN0:98)。
[0024] 图9 ;显示本发明的表达盒构型。
[00幼序列简述
[0026] 沈QIDN0:1、5、7、9、13、16、18、19、21、23、27、30、32、：M、38、41、43、45、49、52、55、 58、60、62、66、70、72、74、76、78、82、84、86、88、92、95、97、99、103、106、108、110、114、116、 118、120、122、126、128、132、134、138、140、144、148、150和168是包含可操作地5'连接至 前导序列的启动子序列的调控表达元件组巧X巧的DNA序列，所述前导序列可操作地5'连 接至内含子序列。
[0027] 沈QIDN0:2、6、8、10、14、17、22、24、28、31、33、35、39、42、44、46、50、53、56、61、 63、67、71、73、75、77、79、83、85、87、89、93、96、98、100、104、107、109、111、117、119、121、 123、129、135、141、145、151 和 169 是启动子序列。
[0028] 沈Q ID側：3、11、25、36、47、64、68、80、90、101、112、124、130、136、142、146、152和 170是前导序列。
[0029] 沈QIDN0:4、12、15、20、26、29、37、40、48、51、54、57、59、65、69、81、91、94、102、 105、113、115、125、127、131、133、137、139、143、147、149、153 和 171 是内含子序列。
[0030] 发明详述
[0031] 本发明提供植物中具有基因调控活性的DNA分子。该些DNA分子的核巧酸序列是 WSEQIDNO: 1-98和168-171提供的。该些DM分子例如能够影响植物组织中可操作地 连接的可转录DNA分子的表达，并且因此调控转基因植物中可操作地连接的转基因的基因 表达。本发明还提供修饰、产生和使用该些DNA分子的方法。本发明还提供含有本发明的 重组DNA分子的组合物（包括转基因植物细胞、植物、植物部分和种子）W及制备和使用该 些的方法。
[0032] 提供W下定义和方法来更好地限定本发明W及在本发明的实施中指导本领域普 通技术人员。除非另外指出，否则术语根据相关领域的普通技术人员的常规使用方式来理 解。
[0033]DNA分子
[0034] 如本文所用的，术语"DNA"或"DNA分子"是指细胞或合成来源的双链DNA分 子，即，脱氧核糖核巧酸碱基的聚合物。如本文所用的，术语"DNA序列"是指DNA分子 的核巧酸序列。本文中所用的命名按美国联邦法规扣nitedStatesCodeofFederal Regulations) § 1. 822第37款所规定的，并且在WIPO标准ST. 25 (1998)，附录2、表1和3 的表格中有所阐述。
[00巧]如本文所用的，"重组DNA分子"是包含在没有人干预的情况下不会一起天然发生 的DNA分子组合的DNA分子。例如，重组DNA分子可W是包含至少两个相对于彼此异源的 DNA分子的DNA分子、包含源于天然存在的DNA序列的DNA序列的DNA分子、或已通过遗传 转化并入宿主细胞的DNA中的DNA分子。
[0036] 如本文所用的，术语"序列同一性"是指两个最佳比对的DNA序列相同的程度。通 过人工比对两个DNA序列（例如参考序列和另一DNA序列）来产生最佳序列比对，W最大 化具有适当的内部核巧酸插入、缺失或空位的序列比对中核巧酸匹配的数目。如本文所用 的，术语"参考序列"是指WSEQIDNO: 1-98和168-171提供的DNA序列。
[0037] 如本文所用的，术语"序列同一性百分比"或"同一性百分比"或"同一性％ "是同 一性分数乘W100。对于与参考序列最佳比对的DNA序列，"同一性分数"是最佳比对中核巧 酸匹配的数目除W参考序列中的核巧酸总数，例如，整个参考序列的全长中的核巧酸总数。 因此，本发明的一个实施方案提供包含与参考序列（本文中WSEQIDNO: 1-98和168-171 提供）最佳比对时，与参考序列具有至少约85%同一性、至少约86%同一性、至少约87%同 一'f生、至少约88%同一'f生、至少约89%同一'f生、至少约90%同一'f生、至少约91 %同一'f生、至 少约92%同一性、至少约93%同一性、至少约94%同一性、至少约95%同一性、至少约96% 同一'f生、至少约97%同一'f生、至少约98%同一'f生、至少约99%同一'f生或至少约100%同一'f生 的DNA序列的DNA分子。
[00測 调控元件
[003引调控元件（例如启动子、前导序列、增强子、内含子和转录终止区（或3'UTR))是 活细胞中基因的总体表达的有机部分。如本文所用的，术语"调控元件"是指具有基因调控 活性的DNA分子。如本文所用的，术语"基因调控活性"是指例如通过影响可操作地连接的 可转录DNA分子的转录和/或翻译来影响可操作地连接的可转录DNA分子的表达的能力。 因此，在植物中起作用的调控元件（例如启动子、前导序列、增强子和内含子）可用于通过 遗传工程来改变植物表型。
[0040] 如本文所用的，"调控表达元件组"或"EXP"序列可W指一组可操作地连接的调 控元件，例如增强子、启动子、前导序列和内含子。因此，调控表达元件组可w由例如可操作 地5'连接至前导序列的启动子组成，所述前导序列进而可操作地5'连接至内含子序列。
[0041] 调控元件可W通过W下来表征：其基因表达模式，例如，正和/或负效应，例如组 成型表达、或时间、空间、发育、组织、环境、生理、病理、细胞周期和/或化学响应性表达及 其任何组合，W及定量或定性指标。如本文所用的，"基因表达模式"是可操作地连接的 DNA分子转录成转录的RNA分子的任何模式。转录的RNA分子可W翻译而产生蛋白质分 子或可W提供反义或其它调控RNA分子，例如双链RNA(dsRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体 RNA(rRNA)、微RNA(miRNA)等。
[0042] 如本文所用的，术语"蛋白质表达"是转录的RNA分子翻译成蛋白质分子的任何模 式。蛋白质表达可W通过其时间、空间、发育或形态学性质W及通过定量或定性指标来表 征。
[0043]启动子可用作用于调节可操作地连接的可转录DNA分子的表达的调控元件。如 本文所用的，术语"启动子"通常是指参与RNA聚合酶II和其它蛋白质（例如反式作用转 录因子）的识别和结合W起始转录的DNA分子。启动子可W来源于基因的5'非翻译区 (5'UTR)。或者，启动子可W是合成产生或操作的DNA分子。启动子还可W是嵌合的。嵌 合启动子是通过两个或更多个异源DNA分子的融合产生的。可用于实施本发明的启动子 包括沈QIDN0:2、6、8、10、14、17、22、24、28、31、33、35、39、42、44、46、50、53、56、61、63、67、 71、73、75、77、79、83、85、87、89、93、96、98和169，包括其片段或变体。在本发明的特定实施 方案中，如本文所述的该些DM分子和其任何变体或衍生物进一步被定义为包含启动子活 性，即，能够在宿主细胞中（例如，在转基因植物中）充当启动子。在再一特定实施方案中， 可W将片段定义为展现出其所来源的起始启动子具有的启动子活性，或片段可W包含"最 小启动子"，所述"最小启动子"提供基础转录水平，并且包含TATA框或用于RNA聚合酶II 复合物的识别和结合W实现转录起始的等同DM序列。
[0044] 在一个实施方案中，提供如本文所公开的启动子序列的片段。启动子片段可W包 含如上所述的启动子活