用用于cDNA端快速扩增的5'RACE系统，版本2. 0(lnvitrogen，Carlsbad,化lifornia 92008)，通过分析由此产生的信使RNA(mRNA)转录物的序列来确认调控元件TSS和内含子 /外显子剪接点。
[0098]鉴定的EXP的DNA序列在本文中作为SEQIDN0:l、5、7、9、13、16、18、19、21、23、 27、30、32、34、38、41、43、45、49、52、55、58、60、62、66、70、72、74、76、78、82、84、86、88、92、 95、97、99、103、106、108、110、114、116、118、120、122、126、128、132、134、138、140、144、148、 150和168提供，如下表1中所列。启动子序列在本文中作为SEQIDNO: 2、6、8、10、14、17、 22、24、28、31、33、35、39、42、44、46、50、53、56、61、63、67、71、73、75、77、79、83、85、87、89、 93、96、98、100、104、107、109、111、117、119、121、123、129、135、141、145、151 和 169 提供。 前导序列在本文中作为SEQIDN0:3、ll、25、36、47、64、68、80、90、101、112、124、130、136、 142、146、152 和 170 提供。内含子序列在本文中作为SEQIDN0:4、12、15、20、26、29、37、 40、48、51、54、57、59、65、69、81、91、94、102、105、113、115、125、127、131、133、137、139、143、 147、149、153 和 171 提供。
[009引表1.从各种草类物种分离的调控表达元件组（"EXP")、启动子、增强子、前导序 列和内含子。
[0100]
[0101]
[0102]
[0103]
[0104]
[0105]
[0106]如表1中所示，例如，命名为EXP-AG化e.化ql: 1:7(SEQIDNO: 1)的调控EXP 序列（其具有从云草分离的组分）包含可操作地5'连接至前导序列元件L-AG化e. 化ql-l:l:l(SEQIDN0:3)的启动子元件P-AG化e.化ql-l:l:5(SEQIDN0:2)，所述前导序 列元件可操作地5'连接至内含子元件I-AG化e.化ql-l:l:3(SEQIDN0:4)。其它EXP序 列相似地连接，如表1中所概述的。
[0107]如表1、序列表和图1-8中所示，将来自云草、芦竹、格兰马草、中国芒、裂释草和 黄假高梁的启动子序列的变体工程化，所述变体包含例如P-AG化e.化ql-1:1:5(SEQID N0:2)、P-ARUdo.化ql-l:l:4(SEQIDN0:10)或来自其它物种的其它相应启动子的较短启 动子片段，并且例如得到P-AG化e.化ql-l:l:4(SEQIDN0:6)和P-ARUdo.化ql-l:l:5(SEQ IDNO: 14)，W及其它启动子片段。
[010引表1中还列示了使用相同引物组分离的S个等位基因变体，所述引物组被设计用 于来自墨西哥玉米的基因组DNA的扩增。墨西哥玉米EXP序列的等位基因变体包含在其 它DNA序列的各个区域内共有一定同一性的DNA序列，但在每个EXP序列的每个启动子、 前导序列和/或内含子内的插入、缺失和核巧酸错配也可W是明显的。命名为EXP-Zm. 化qMl:l:6(SEQ ID N0:122)和EXP-Zm.化qMl:l:10(SEQ ID N0:126)的EXP序列表示墨西 哥玉米化ql基因调控表达元件组的第一等位基因（等位基因-1)，两个EXP序列之间仅有 的差异出现在3'内含子剪接点的序列5' -AG-3'之后的每个相应内含子的最后3'核巧 酸中。命名为6《口-2111.化9]\11:1:7669 10側：128)和6《口-2111.化9]\11:1:12669 10側：132) 的EXP序列表示墨西哥玉米化ql基因调控表达元件组的第二等位基因（等位基因-2)， 两个EXP序列之间仅有的差异出现在3'内含子剪接点的序列5' -AG-3'之后的每个相 应内含子的最后3'核巧酸中。EXP序列EXP-Zm.化qMl:l:8(SEQ ID N0:134)和EXP-Zm. 化qMl:l:ll(SEQ ID N0:138)表示墨西哥玉米化ql基因调控表达元件组的第S等位基因 (等位基因-3)，两个EXP序列之间仅有的差异出现在3'内含子剪接点的序列5' -AG-3' 之后的每个相应内含子的最后3'核巧酸中。
[0109] 实施例2
[0110] 使用GUS表达盒扩增子分析玉米原生质体中驱动GUS的调控元件
[01U] 在下文所呈现的一系列实验中，用源自含有驱动0-葡糖巧酸酶转基因佑U巧表 达的EXP序列的植物表达载体的DNA扩增子转化玉米叶原生质体，并且与其中通过已知组 成型启动子驱动GUS表达的叶原生质体进行比较。
[0112]在第一组实验中，如上文用从包含GUS表达盒的植物表达载体的扩增产生 的扩增子转化源自叶组织的玉米原生质体细胞，W将通过W下中的一个驱动的转基 因佑U巧的表达与已知组成型启动子驱动的表达进行比较；EXP-AG化e.化ql:l:7(SEQ ID N0:1)、EXP-AG化e. m3ql:l:8(SEQ ID N0:5)、EXP-AG化e. m3ql:l:9(SEQ ID N0:7)、 EXP-ARUdo.化ql:l:8(SEQ ID N0:13)、EXP-A抓do.化ql:l:9(SEQ ID N0:16)、EXP-ARUdo. m3ql:l:ll(SEQ ID N0:20)、EXP-ARUdo.Ubq2:l:8(SEQ ID N0:26)、EXP-ARUdo. m3q2:l:9(SEQ ID N0:29)、EXP-ARUdo.Ubq2:l:10(SEQ ID N0:31)、EXP-B0Ugr. 化ql:l:6(SEQ ID N0:37)、EXP-B0Ugr.化ql:l:7(SEQ ID N0:40)、EXP-B0Ugr.化ql:l:8(SEQ ID N0:42)、EXP-B0Ugr.化q2:l:14(沈Q ID N0:51)、EXP-B0Ugr.化q2:l:16(沈Q ID N0:57)、 EXP-BOUgr.化q2:l:17(沈Q ID N0:59)、EXP-MISsi.化ql:l:8(SEQ ID N0:69)、EXP-MIS si. Ubql: 1:10(SEQ ID NO: 71). EXP-MISsi. Ubql: 1:11(SEQ ID NO: 73) . EXP-MISsi. 化ql:l:7(SEQ ID N0:75)、EXP-SCHsc.化ql:l:9(SEQ ID N0:77)、EXP-SCHsc.化ql:l:7(SEQ IDN0:83)、EXP-SCHsc.师ql:l:10(SEQIDN0:85)、EXP-S0Rnu.m3ql:l:6(SEQID N0:91)、EXP-S0foui.m3ql:l:7(SEQIDN0:94)、EXP-S0foui.m3ql:l:8(SEQIDN0:96)、 EXP-SETit.W3ql:l:5(SEQIDN0:102)、EXP-SETit.W3ql:l:7(SEQIDN0:105)、EXP-SETit. 化ql:l:6(SEQIDN0:107)、EXP-Sv.m3ql:l:7(SEQIDN0:109)、EXP-Sv.化ql:l:8(SEQ IDN0:115)、EXP-Sv.化ql:l:10(沈QIDN0:117)、EXP-Zm.化qMl:l:6(沈QIDN0:121)、 EXP-Zm.师qMl:l:7(SEQIDN0:127)、EXP-Zm.师qMl:l:8(SEQIDN0:133)、Exp-Sb. 化94:1:266910側：139)和6义9-訊.化96:1:266910側：143)。使用本领域已知的方法， 将包含产生表达盒扩增子的扩增模板的每个EXP序列克隆至下表2中标题"扩增子模板"下 所示的植物表达载体中。所得到的植物表达载体包含表达盒，所述表达盒包含可操作地5' 连接至含有可加工的内含子("GUS-2"，SEQIDN0:154)或连续GUS编码序列（"GUS-1"，SEQ IDN0:153)的GUS编码序列的EXP序列，所述GUS编码序列可操作地5'连接至3'UTR T-AG化u.nos-l:l:13(SEQIDN0:157)或T-I'a.Hspl7-l:l:l(SEQIDN0:158)。使用下表 2中呈现的质粒构建体模板，使用本领域技术人员已知的方法来产生扩增子。简单地说，设 计5'寡核巧酸引物W使其与启动子序列退火，并且将在3'UTR的3'端退火的3'寡核 巧酸引物用于每个表达盒的扩增。通过使用设计成在包含每个扩增子模板的启动子序列内 的不同位置退火的不同寡核巧酸引物，将连续的5'缺失引入包含表达盒的启动子序列中， W产生不同的EXP序列。
[0113] 表2.用于玉米叶原生质体转化的GUS植物表达扩增子和相应的质粒构建体扩增 子模板、EXP序列、GUS编码序列和3'UTR。
[0114]
[011 引
[0116]
[0118] 表2中列为扩增子模板的质粒构建体用作用于包含表2中所列EXP序列的转基因 表达盒的扩增的模板。如先前所述的，用组成型EXP序列EXP-Os. Actl: 1:9(SEQ ID NO: 162) 和EXP-CaMV. 35S-enh+Ta. liicbl+Os.Actl:l:l(SEQ ID N0:161)来构建用于产生用于比较 的GUS转基因扩增子的对照质粒。使用并不设计用于转基因表达的空载体作为阴性对照来 评价背景GUS和巧光素酶表达。
[0119] 还使用本领域已知方法构建了两个用于共转化和数据的标准化的质粒。每个质粒 含有通过组成型EXP序列驱动的特定巧光素酶编码序列。植物载体PM0N19437包含具有可 操作地5'连接至内含子巧XP-CaMV. 35S-enh+Zm.DnaK: 1: 1，SEQIDNO: 163)的组成型启动 子的表达盒，所述内含子可操作地5'连接至蛋火虫（北美蛋火虫（Photinuspyralis))巧 光素酶编码序列（巧光素酶：1:3,SEQIDN0:156)，所述巧光素酶编码序列可操作地5'连 接至来自根癌农杆菌姻脂碱合成酶基因的3'^'3订-46化11.11〇3-1:1:13,569 10^:158)。 植物载体PM0N63934包含具有组成型EXP序列巧XP-CaMV. 35S-enh-liicbl，SEQIDN0:164) 的表达盒，所述组成型EXP序列可操作地5'连接至海肾巧enillareni化rmis)巧光素酶 编码序列佑3-1?611.111?6111113山^'6-0:0:1，569 10側：157)，所述巧光素酶编码序列可操 作地5'连接至来自根癌农杆菌姻脂碱合成酶基因的3'町3订-46化11.11〇3-1:1:13,569 10 NO:158)〇
[0120] 使用本领域所熟知的基于阳G的转化方法来转化玉米叶原生质体。用PM0N19437 质粒DNA、PM0N63934质粒DNA和表2中所呈现的扩增子转化原生质体细胞，并且将其在完 全黑暗中解育过夜。通过将如上文转化的细胞的溶解制剂的等分试样置于两个不同的小孔 托盘中来进行GUS与巧光素酶两者的测量。一个托盘用于GUS测量，并且第二个托盘用于 使用双巧光素酶报告基因测定系统（Promega公司，Madison,WI;参见例如PromegaNotes Magazine,第57期，1996,第02页）进行双巧光素酶测定。对每个EXP序列进行一次或两 次转化并且从来自每个转化实验的数个样品确定每个EXP序列的平均表达值。每次EXP序 列构建体转化使用4个重复，或可选地，每两次转化实验中的一次，每个EXP序列扩增子使 用3个重复，进行样品测量。平均GUS和巧光素酶表达水平提供于表3中。在此表中，蛋火 虫巧光素酶值（例如，来自PM0N19437的表达）提供于标记为"FLuc"的一栏中并且海肾巧 光素酶值提供于标记为"RLuc"的一栏中。
[0121] 表3.转化的玉米叶原生质体细胞中的平均GUS和巧光素酶活性。
[0122]
[0123]
[0124] 为了比较每个EXP序列的相对活性，将GUS值表示为GUS与巧光素酶活性的比 率，并且相对于对EXP-Os.Actl: 1:1 和EXP-CaMV. 35S-enh+Ta.liicbl+Os.Actl: 1:1 观 察到的表达水平进行标准化。下表4显示玉米原生质体中相对于EXP-〇s.Actl:l:l和 EXP-CaMV. 35S-enh+Ta.liicbl+Os.Actl: 1:1驱动的表达标准化的GUS/化UC表达比率。下 表 5 显示玉米原生质体中相对于EXP-Os.Actl: 1:1 和EXP-CaMV. 35S-enh+Ta.liicbl+Os. Actl: 1:1驱动的表达标准化的GUS/FLuc表达比率。
[0125]表 4.玉米原生质体中相对于EXP-CaMV. 35S-enh+Ta.liicbl+Os.Actl:l:l(SEQID NO: 161)标准化的GUS/RLuc和GUS/化uc表达比率。
[0126]
[0127]
[0128] 表5.玉米叶原生质体中相对于EXP-Os.Actl:l:9(SEQIDN0:162)标准化的GUS/ RLuc和GUS/化uc表达比率。
[0129]
[0130]
[0131] 如在表9和10中可W看出，所有EXP序列均能够驱动玉米细胞中的GUS转基 因表达。相对于EXP-〇s.Actl:l:9,所有EXP序列的平均GUS表达均较高。EXP序列 EXP-AG化e. m3ql:l:7(SEQ ID N0:1)，EXP-AG化e. m3ql:l:8(SEQ ID N0:5)，EXP-AG化e. 化ql:l:9(SEQ ID N0:7)，EXP-ARUdo.化ql:l:8(SEQ ID N0:13)、EXP-ARUdo.化ql:l:9(SEQ 10側：18)、6乂口-八抓(1〇.师91:1:11(569 10側：21)、￡乂口-八抓(1〇.加92:1:8(569 10 N0:27)、EXP-AWdo.Ubq2:l:9KEQIDN0:30)、EXP-ARUdo.W3q2:l:10KEQIDN0:32)、 EXP-BOUgr.化ql:l:6(SEQ ID N0:38)、EXP-B0Ugr.化ql:l:7(SEQ ID N0:41)、EXP-B0Ugr. 师q2:l:14(SEQ ID N0:52)、EXP-B0Ugr. m3q2:l:16(SEQ ID N0:58)、EXP-B0Ugr. Ubq2:l:17(SEQ ID N0:60)、EXP-MISsi.m3ql:l:10(SEQ ID N0:72)、EXP-SCHsc. m3ql:l:7(SEQ ID N0:84)、EXP-SCHsc.m3ql:l:10(SEQ ID N0:86)、EXP-S0Rnu. 化ql:l:7(SEQ ID N0:95)、EXP-S0Rnu.化ql:l:8(SEQ ID N0:97)、EXP-SETit.化ql:l:5(SEQ 10側：103)、6《口-561'11.化91:1:7(569 10側：106)、6《口-561'11.师91:1:6(569 10 N0:108)、EXP-Sv.化ql:l:7(SEQ ID N0:110)、EXP-Sv.化ql:l:8(SEQ ID N0:116)、EXP-Sv. 化ql:l:10(沈Q ID N0:118)、EXP-Zm.化qMl:l:6(沈Q ID N0:122)、EXP-Zm.化qMl:l:8(沈Q ID N0:1：M)、EXP-Sb.化q4:l:2(SEQ ID N0:140)和EXP-Sb.化q6:l:2(SEQ ID N0:144)展 不高于EXP-CaMV. 35S-enh+Ta. liicbl+Os. Actl: 1:1的GUS表达水平。
[013引在第二组实验中，将包含EXP序列EXP-Zm.化qMl: 1:7(SEQ ID NO: 128)的 GUS表达盒扩增子与对照扩增子PCR0145942巧XP-Os.Actl: 1:9,SEQIDNO: 162)和PCR0145944巧XP-CaMV. 35S-enh+Zm.DnaK:l:l，SEQIDN0:161)进行关于GUS表达的比较。 通过EXP序列EXP-Zm.化qMl: 1:7驱动的GUS表达高于两个对照。下表6显示对于每个扩 增子确定的平均GUS和巧光素酶值。下表7显示玉米原生质体中相对于EXP-Os.Actl: 1:9 和EXP-CaMV. 35S-enh+Zm.DnaK: 1:1驱动的表达标准化的GUS/RLuc和GUS/化UC表达比率。
[0133] 表6.转化的玉米叶原生质体细胞中的平均GUS和巧光素酶活性.
[0134]
[013引 表7.玉米叶原生质体中相对于EXP-Os.Actl: 1:9(SEQIDNO: 161)和 EXP-CaMV. 35S-enh+Zm.DnaK: 1:1(SEQIDNO: 160)标准化的GUS/RLuc和GUS/化uc表达比 率。
[0136]
[0137] 可W在甘庶叶原生质体中相似地研究调控元件驱动来自扩增子的GUS表达的的 效力。例如，可W用源自含有EXP序列（驱动GUS转基因的表达）的植物表达载体的DNA 扩增子转化甘庶原生质体，并且与其中通过已知组成型启动子驱动GUS的表达的叶原生质 体进行比较。
[013引实施例3
[0139] 使用GUS表达盒扩增子分析小麦原生质体中驱动GUS的调控元件
[0140] 用源自含有EXP序列（驱动GUS转基因的表达）的植物表达载体的DNA扩增子转 化小麦叶原生质体，并与其中通过已知组成型启动子驱动GUS的表达的叶原生质体进行比 较。
[0141