l.化qlO(沈QID NO: 168)驱动的表达在花药中较高，但在抽穗丝中较低，而通过EXP-BOUgr.化ql: 1:6(SEQ IDNO:38)驱动的在抽穗丝中的表达高于在花药中的表达。
[0198] 发育中的种子（21DAP胚芽和胚乳）中的表达在EXP序列之间是不同的。EXP 序列EXP-Zm.化qMl:l:10(SEQIDN0:126)、EXP-Zm.化qMl:l:12(SEQIDN0:132)和 EXP-Zm.化qMl:l:ll(SEQIDN0:138)驱动发育中的种子胚芽和胚乳组织中的高GUS表 达。当通过EXP序列EXP-ARUdo.化ql:l:8(SEQIDN0:13)、EXP-ARUdo.化ql:l:9(SEQID N0:18)、EXP-ARUdo.化q2:l:8(SEQIDN0:27)、EXP-B0Ugr.化q2:l:14(沈QIDN0:52)、 EXP-BOUgr.化q2:l:15(沈QIDN0:55)、EXP-S0化u.化ql:l:6(SEQIDN0:92)、EXP-S0化u. 化ql:l:7(SEQIDN0:95)、EXP-Sv.化ql:l:12(沈QIDN0:120)、EXP-Sb.化q4:l:2(SEQID N0:140)和EXP-Cl.化qlO(SEQIDN0:168)驱动GUS时，胚乳中的表达水平是胚芽中的约2 倍或更高。当通过EXP-Sb.化q7:l:2(SEQIDN0:150)驱动时，GUS在胚芽中的表达是在胚乳 中的 3 倍。当通过EXP序列EXP-AG化e.化ql: 1:7(SEQIDNO: 1)、EXP-AG化e.化ql: 1:8(SEQ IDN0:5)、EXP-B0Ugr.化ql:l:6(SEQIDN0:38)、EXP-B0Ugr.化ql:l:7(SEQIDN0:41)、 EXP-MISsi.化ql:l:7(SEQIDN0:76)、EXP-SETit.化ql:l:10(沈QIDN0:99)和EXP-Sb. 化q6:l:3(SEQIDN0:148)驱动时，GUS表达水平在胚芽和胚乳中是相对等同的。
[0199] 每个EXP序列均展示在稳定转化的玉米植物中驱动转基因表达的能力。然而，每 个EXP序列对于每个组织具有独特的表达模式，并且提供了根据实现所需结果所需要的组 织表达策略来选择将最好地提供特定转基因的表达的EXP序列的机会。本实施例证实，从 同源基因分离的EXP序列不一定在转化的植物中等同地表现，并且所述表达只可W通过对 每个EXP序列的特性的经验研究来确定，并且不可W基于启动子所来源的基因同源性来预 测。
[0200] 实施例6
[0201] 源自调控元件的增强子。
[020引增强子源自本文所提供的启动子元件，例如作为SEQIDN0:2、6、8、10、14、17、22、 24、28、31、33、35、39、42、44、46、50、53、56、61、63、67、71、73、75、77、79、83、85、87、89、93、 96、98和169呈现的那些。增强子元件可W包含一个或多个顺式调控元件，所述顺式调控元 件在可操作地5'或3'连接至启动子元件时，或可操作地5'或3'连接至与启动子可操 作地连接的其它增强子元件时，可W增强或调节转基因的表达，或提供转基因在特定细胞 类型或植物器官中或在发育或昼夜节律的特定时间点的表达。通过从如上所述允许从本文 所提供的启动子启动转录的启动子（包括其片段）去除TATA框或功能相似元件和任何下 游DNA序列来制得增强子，其中去除TATA框或功能相似元件和TATA框下游的DNA序列。 [0203] 增强子元件可W源自本文提供的启动子元件并且使用本领域已知的方法克隆W 可操作地5'或3'连接至启动子元件，或可操作地5'或3'连接至可操作地连接至启动 子的其它增强子元件。或者，使用本领域已知的方法克隆增强子元件W可操作地连接至增 强子元件的一个或多个拷贝，所述一个或多个拷贝可操作地5'或3'连接至启动子元件， 或可操作地5'或3'连接至与启动子可操作地连接的其它增强子元件。增强子元件还可 W被克隆W可操作地5'或3'连接至源自不同属生物体的启动子元件，或可操作地5'或 3'连接至源自其它属生物体或相同属生物体的其它增强子元件（其可操作地连接至源自 相同或不同属生物体的启动子），从而产生嵌合的调控元件。与先前实施例中所述的构建 体相似，使用本领域已知的方法来构建GUS表达植物转化载体，其中所得到的植物表达载 体含有来自根癌农杆菌的右边界区；用W测试调控或嵌合调控元件的第一表达盒，其包含 调控或嵌合调控元件，所述调控或嵌合调控元件可操作地连接至源自玉米化mays)服P70 热休克蛋白的内含子（I-Zm.DnaK-l:l:lSEQIDN0:165)或本文所呈现的任何内含子或任 何其它内含子，所述内含子可操作地连接至具有可加工内含子佑US-2，SEQIDN0:155)或 无内含子佑US-1，SEQIDNO: 154)的GUS编码序列，所述GUS编码序列可操作地连接至来 自根癌农杆菌的姻脂碱合成酶的3'UTR(T-AG化U.nos-l:l:13，SEQIDN0:158)或来自水 稻脂质转移蛋白基因的3'UTR(T-〇s.LTP-l:l:l，SEQIDN0:160);第二转基因选择盒，用 于选择赋予除草剂草甘麟（通过水稻肌动蛋白1启动子驱动）或可选地抗生素卡那霉素 化anamycin)(通过水稻激动蛋白1启动子驱动）抗性的转化的植物细胞；和来自根癌农杆 菌的左边界区。通过上述方法或通过本领域已知的其它农杆菌介导的方法或颗粒轰击方 法，将所得到的质粒用于转化玉米植物或其它属的植物。或者，使用本领域已知的方法来转 化源自玉米或其它属植物的原生质体细胞W进行瞬时测定。
[0204] 在稳定的或瞬时的植物测定中，评估通过包含一个或多个增强子的调控元件驱动 的GUS表达，W确定增强子元件对转基因表达的作用。基于经验实验和使用每个调控元件 组合物观察到的所得基因表达调控，进行对一个或多个增强子元件的修饰或一个或多个增 强子元件的复制。改变所得到的调控或嵌合调控元件中一个或多个增强子的相对位置可W 影响调控或嵌合调控元件的转录活性或特异性，并且根据经验进行确定W鉴定用于玉米植 物或其它属植物内所需转基因表达谱的最佳增强子。
[0205] 实施例7
[0206] 使用植物源的原生质体来分析GUS活性的内含子增强。
[0207] 基于实验W及与无内含子表达载体对照的比较来选择内含子，W根据经验选择用 于最佳转基因表达的内含子和载体转移DNA(T-DNA)元件布置内的构型。例如，在除草剂抗 性基因（例如赋予草甘麟耐受性的CP4)的表达中，期望在生殖组织W及营养组织内具有转 基因表达W防止施用除草剂时的产量损失。该种情况下的内含子将基于其可操作地连接 至组成型启动子时增强赋予除草剂抗性的转基因的表达的能力来选择，特别是在转基因植 物的生殖细胞和组织内，并且由此在喷施除草剂时为转基因植物提供营养性和生殖性耐受 性。在多数泛素基因中，5'UTR包含在其内嵌有内含子序列的前导序列。因此使用包含启 动子、前导序列和内含子的完整5'UTR来测定源自该样的基因的调控元件。为了获得不同 的表达谱或为了调节转基因表达的水平，可W去除所述表达元件中的内含子或用异源内含 子替代所述内含子。
[020引使用基因组DNA重叠群鉴定本文作为SEQIDN0:4、12、15、20、26、29、37、40、48、 51、54、57、59、65、69、81、91、94和171呈现的内含子，与表达的序列标签簇或00臟重叠群 进行比较，W鉴定基因组DM内的外显子和内含子序列。另外，还使用5'UTR或前导序列 来限定在基因序列编码被一个或多个内含子中断的前导序列时的条件下一个或多个内含 子的内含子/外显子剪接点。使用本领域已知的方法将内含子克隆至植物转化载体中，W 可操作地3'连接至调控元件和前导片段W及可操作地5'连接至第二前导片段或编码序 列，例如，如图9中呈现的表达盒中所描绘的。
[0209] 因此，例如，第一个可能的表达盒（图9中的表达盒构型1)包含启动子或嵌合启 动子元件[A]，[A]可操作地5'连接至前导元件巧]，出]可操作地5'连接至测试内含子 元件[C]，[C]可操作地连接至编码区巧]，[D]可操作地连接至3'UTR元件圧]。或者，第 二个可能的表达盒（图9中的表达盒构型2)包含启动子或嵌合启动子元件[円，[円可操 作地5'连接至第一前导元件或第一前导元件片段[G]，[G]可操作地5'连接至测试内含 子元件出]，出]可操作地5'连接至第二前导元件或第一前导元件第二片段[I]，[I]可操 作地连接至编码区[J]，[J]可操作地连接至3'UTR元件怔]。此外，第S个可能的表达盒 (图9中的表达盒构型3)包含启动子或嵌合启动子元件[L]，[L]可操作地5'连接至前导 元件[M]，[M]可操作地5'连接至编码序列元件的第一片段[闲，[闲可操作地5'连接至 内含子元件[0]，[0]可操作地5'连接至编码序列元件的第二片段[P]，[門可操作地连接 至3'UTR元件阳])。表达盒构型3被设计成允许内含子W产生完整的开放阅读框而在编 码序列的第一和第二片段之间没有移码的方式来剪接。
[0210] 如W上讨论的，可能优选的是避免紧接在剪接位点（GT)的5'端之前使用核巧酸 序列AT或核巧酸A，W及避免分别紧接在剪接位点（AG)的3'端之后使用核巧酸G或核巧 酸序列TG，W消除信使RNA加工成最终转录物期间形成不需要的起始密码子的可能。因此 可W修饰内含子的5'或3'端剪接点位点周围的DNA序列。
[0211] 通过在瞬时测定或稳定的植物测定中增强表达的能力来测定内含子的增强作用。 对于内含子增强的瞬时测定来说，使用本领域已知的方法来构建基础植物载体。将内含子 克隆至基础植物载体中，所述基础植物载体包含表达盒，所述表达盒包含组成型启动子， 例如花挪菜花叶病毒启动子？-〔31￥.355-6油-1:1:9(569 10^:166)，所述启动子可操作 地5'连接至前导序列元件心〔31￥.355-1:1:15669 10側:167)，所述前导序列元件可操 作地 5'连接至测试内含子元件（例如SEQIDN0:4、12、15、20、26、29、37、40、48、51、54、 57、59、65、69、81、91、94和171中的一个），所述测试内含子元件可操作地连接至具有可 加工内含子（GUS-2，SEQIDN0:155)或无内含子（GUS-1，SEQIDN0:154)的GUS编码序 列，所述GUS编码序列可操作地连接至来自根癌农杆菌的姻脂碱合成酶3'UTR(T-AG化u. nos-1:1:13,SEQIDNO: 158)。用基础植物载体和如W上实施例2中先前所述的巧光素酶 对照载体转化源自玉米或其它属植物组织的原生质体细胞，并且测定活性。为了比较内含 子增强表达的相对能力，将GUS值表示为GUS与巧光酶活性的比率，并且与如下构建体所赋 予的那些水平进行比较；包含可操作地连接至已知内含子标准物（例如源自玉米服P70热 休克蛋白的内含子I-Zm.DnaK-l:l:l(SEQIDN0:165))的组成型启动子的构建体化及包含 所述组成型启动子但没有可操作地连接至所述启动子的内含子的构建体。
[0引引 对于作为沈QIDN0:4、12、15、20、26、29、37、40、48、51、54、57、59、65、69、81、 91、94和171呈现的内含子的稳定植物测定来说，与先前实施例中所述的构建体相似地 构建GUS表达植物转化载体，其中所得到的植物表达载体含有来自根癌农杆菌的右边界 区；用W测试内含子的第一表达盒，其包含组成型启动子，例如花挪菜花叶病毒启动子 ?-〔3]\^.355-6油-1:1:9 669 10^:166)，所述启动子可操作地5'连接至前导序列元件 L-CaMV. 35S-1:1:15(SEQIDNO: 167)，所述前导序列元件可操作地5'连接至本文所提供 的测试内含子元件，所述测试内含子元件可操作地连接至具有可加工内含子佑US-2，SEQ IDN0:155)或没有内含子佑US-1，SEQIDN0:154)的GUS编码序列，所述GUS编码序列 可操作地连接至来自根癌农杆菌的姻脂碱合成酶3'町3订-46化11.11〇3-1:1:13,569 10 NO: 158);第二转基因选择盒，用于选择赋予草甘麟（通过水稻肌动蛋白1启动子驱动）或 可选地抗生素卡那霉素（通过水稻激动蛋白1启动子驱动）抗性的转化的植物细胞；和来 自根癌农杆菌的左边界区。通过上述方法或通过本领域已知的农杆菌介导的方法，将所得 到的质粒用于转化玉米植物或其它属的植物。选择单拷贝或低拷贝数的转化体用于与单 拷贝或低拷贝数的转化植物进行比较，W确定测试内含子是否提供了内含子介导的增强作 用，所述单拷贝或低拷贝数的转化植物已用与测试载体相同但不含测试内含子的植物转化 载体转化。
[021引 可W多种方式修饰作为SEQIDN0:4、12、15、20、26、29、37、40、48、51、54、57、59、 65、69、81、91、94和171呈现的任何内含子，所述方式例如使内含子序列内的如下片段缺 失，所述片段可W降低可W增强表达的内含子片段的表达或复制。另外，可W使内含子内可 W影响特定细胞类型或组织和器官的表达特异性的DNA序列复制或改变或缺失W影响转 基因的表达和表达模式。另外，本文所提供的内含子可W经修饰W去除任何可能的如下起 始密码子（ATG)，所述起始密码子可能引起从不恰当剪接的内含子表达无意的转录物而成 为不同的、较长的或截短的蛋白质。一旦根据经验测试了内含子，或已基于实验对其进行了 改变，则将内含子用于增强转基因在稳定转化的植物中的表达，所述稳定转化的植物可W 是任何属的单子叶植物或双子叶植物，只要内含子提供转基因的增强。内含子还可W用于 增强其它生物体（例如藻类、真菌或动物细胞）中的表达，只要内含子提供与其可操作地连 接的转基因的表达的增强或减弱或特异性。
[0214] 水水水水水水水
[0215] 尽管已经说明和描述了本发明的原理，但本领域技术人员应当明白，可W在布置 和细节方面修改本发明而不脱离该些原理。我们要求在权利要求的精神和范围内的所有修 改。本文所引用的所有出版物和公开的专利申请均在此W引用方式并入，其并入程度如同 具体地且个别地指示将每一个别出版物或专利申请W引用方式并入一般。
【主权项】
1. 一种重组DNA分子，其包含选自由以下组成的组的DNA序列： a) 与SEQ ID NO: 1-98和168-171中任一个具有至少85%序列同一性的DNA序列； b) 包含SEQ ID NO: 1-98和168-171中任一个的DNA序列；和 c) SEQ ID NO: 1-98和168-171中任一个的片段，其中所述片段具有基因调控活性； 其中所述DNA序列可操作地连接至异源可转录DNA分子。2. 如权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述DNA序列与SEQ ID NO: 1-98和168-171 中任一个的所述DNA序列具有至少90%序列同一性。3. 如权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述DNA序列与SEQ ID NO: 1-98和168-171 中任一个的所述DNA序列具有至少95%序列同一性。4. 如权利要求1所述的DNA分子，其中所述异源可转录DNA分子是农学目的基因。5. 如权利要求4所述的重组DNA分子，其中所述农学目的基因赋予植物除草剂耐受性。6. 如权利要求4所述的重组DNA分子，其中所述农学目的基因赋予植物抗虫性。7. -种构建体，其包含如权利要求1所述的重组DNA分子。8. -种转基因植物细胞，其包含重组DNA分子，所述重组DNA分子包含选自由以下组成 的组的DNA序列： a) 与SEQ ID NO: 1-98和168-171中任一个具有至少85%序列同一性的DNA序列； b) 包含SEQ ID NO: 1-98和168-171中任一个的DNA序列；和 c) SEQ ID NO: 1-98和168-171中任一个的片段，其中所述片段具有基因调控活性； 其中所述DNA序列可操作地连接至异源可转录DNA分子。9. 如权利要求8所述的转基因植物细胞，其中所述转基因植物细胞是单子叶植物细 胞。10. 如权利要求8所述的转基因植物细胞，其中所述转基因植物细胞是双子叶植物细 胞。11. 一种转基因植物或其部分，其包含重组DNA分子，所述重组DNA分子包含选自由以 下组成的组的DNA序列： a) 与SEQ ID NO: 1-98和168-171中任一个具有至少85%序列同一性的DNA序列； b) 包含SEQ ID NO: 1-98和168-171中任一个的DNA序列；和 c) SEQ ID NO: 1-98和168-171中任一个的片段，其中所述片段具有基因调控活性； 其中所述DNA序列可操作地连接至异源可转录DNA分子。12. -种如权利要求11所述的转基因植物的子代植物，其中所述子代植物包含所述重 组DNA分子。13. -种如权利要求11所述的转基因植物的转基因种子，其中所述种子包含所述重组 DNA分子。14. 一种表达可转录DNA分子的方法，其包括获得根据权利要求11所述的转基因植物 并且栽培所述植物，其中所述可转录DNA分子被表达。15. -种生产转基因植物的方法，其包括： a) 用如权利要求1所述的重组DNA分子转化植物细胞以产生转化的植物细胞；和 b) 从所述转化的植物细胞再生转基因植物。
【专利摘要】本发明提供了可用于调节植物、植物细胞、种子和子代植物中的基因表达的新颖的重组DNA分子和构建体。本发明还提供了包含本发明的重组DNA分子的转基因植物、植物细胞、植物部分、种子和子代植物，以及它们的使用方法。
【IPC分类】C12N15/113
【公开号】CN104995301
【申请号】CN201380073148
【发明人】S·弗拉辛斯基
【申请人】孟山都技术公司
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2013年12月17日
【公告号】CA2895184A1, EP2935586A2, US20140189909, WO2014100009A2, WO2014100009A3