得的样品质量相 比，25°C/60%RH和25°C/80%RH下的吸水量分别为0? 7%和I. 5%;
[0183] -80-90%RH，快速和几乎恒定的吸水率；与在0%RH下初始干燥后获得的样品质 量相比，25°C/90%RH下的吸水量为9.7%;
[0184]-然后吸水率进一步增加且与在0 %RH下初始干燥后获得的样品质量相比， 25°C/95%RH下的水蒸汽的吸收为19. 4%。
[0185] 解吸附后，观察到对应于不同的吸水率和性能的三种相对湿度间隔：
[0186] -95-90%RH，残余含水率快速降低，与在0%RH下初始干燥后获得的样品质量相 比，25°C/75%RH下残余 10% ;
[0187] -75-10%RH，样品以强烈和几乎恒定的滞后作用保留"吸附的"水，（在25°C/75% RH下高达6. 7% );
[0188] -10-0%RH:样品失去其一部分水；与在0%RH下初始干燥后获得的样品质量相 比，25°C/0%RH下残余的水量为4.6%;该阶段样品质量稳定，因此与周围环境平衡。
[0189] 基于常用的标准（即如果化合物在25°C/60%RH下按重量计存在超过2%的吸水 量，则认为其是吸湿性的），实施例3的硫酸盐在25°C/60%RH下不是吸湿性的，在该阶段 仅有总质量吸收。
[0190] 考虑到在80 %RH下的快速吸水量，以及强烈的滞后作用（解吸附后80-10%RH下 残余6-6. 7 %的水），原来以其非溶剂合物形式获得的实施例3的硫酸盐在高RH下转化为 二水合形式。实施例3的二水合形式的N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基）丙基）哌嗪-1-基） 丙基）-IH-苯并[d]咪唑-2-胺，Ieq硫酸盐的理论吸水量是6. 8%，与用实验方法测定的 6. 7%一致。
[0191] 在上述第一DVS循环结束时，将相同样品送至具有第二吸咐阶段和第二解吸附阶 段的第二DVS循环。结果如图18所示。第二吸咐阶段和第二解吸附阶段均与在第一DVS 循环期间获得的第一解吸附阶段曲线相同。事实上，如同可从图18看到，解吸附阶段和吸 咐阶段彼此重叠。因此，在第一循环期间在25°C下在超过80%RH下获得的实施例3的二 水合形式的N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基）丙基）哌嗪-1-基）丙基）-lH-苯并[d]咪 P坐-2-胺，Ieq硫酸盐是稳定和非吸湿性的。
[0192] 生物实施例
[0193] 体外APP代谢试验
[0194] 采用以实施例2硫酸盐处理24h的SH-5Y5Y细胞（过表达野生型人APP的人神 经母细胞瘤细胞系）进行该试验。该测试以〇.3、1、3和IOiiM的四种不同的化合物浓度 进行。不同代谢物的定量通过蛋白质印迹分析实现。利用作为内部对照的抗肌动蛋白 ((]>19)(SC_1616SantaCruzBiotechnology;200iig/ml母液的 1:1000)和抗-Cterm APP抗体（洗涤缓冲液中1:250000)分析CTFa、CTF和Al⑶。通过BCA蛋白试验试剂盒 (ThermoScientific)测定蛋白浓度。将样品（20yg总蛋白）根据各蛋白的分子量通过 16%SDS-PAGE分离，并转移至硝化纤维膜。
[0195] 结果如图19-a、19-b、19_c和19-d所示。它们显示AIOXCTFa和sAPPa的剂量 依赖性增加的水平和Af3i42的降低水平。
[0196] 因此实施例2的硫酸盐通过非淀粉样原性通道诱导APP代谢的显著增加，并伴随 淀粉样蛋白斑块形成中涉及的有害代谢物形成的降低。这些结果更加显著，因为就淀粉样 蛋白斑块形成而言AP142是最有害的APP代谢副产物。此外，肽sAPPa不诱导淀粉样蛋白 斑块形成，且在一定程度上被认为具有的神经保护作用。
[0197] 此外，注意到这种硫酸盐没有发现细胞毒性，发现其在SH-5Y5Y细胞系上的0：5。大 于30yM。CC5。在本文中定义为50%铺板细胞保持存活的浓度。
[0198] 体内APP代谢试验
[0199] 体内实验在4个月大的C57B16雌性小鼠或2个月大的SpragueDawley大鼠上进 行。
[0200] 短期处理：24hp. 〇?
[0201] C57B16 雌性小鼠用 0? 25、0. 5、1、3 和 6mg/kgmg/kg(n= 6 每组）的媒介物 或化合物（实施例2) 口服（灌胃法）处理24h。产品用一次性啮齿动物饲管ECHMED Ref#V0104030(4mmx30mm)施用。24h后处死动物，立即去除脑用于解剖。额叶皮层（FC)和 /或海马（HIP)中CTFa水平通过之前描述的蛋白质印迹分析来测量。简言之，在罐中将组 织用200yL裂解缓冲液（IOmLLaemmli预裂解缓冲液和1片蛋白酶抑制剂鸡尾酒Complete Mini片剂（Roche))勾质化。超声波降解（5min)后，将组织勾衆以1600rpm4°C离心5min。 等分上清液并在蛋白质印迹分析之前储存于-80°C。
[0202] 剂量依赖性结果如图20所示。实施例2化合物通过所示的额叶皮层中的非淀粉 样原性通道通过增加CTFa的浓度而增强APP代谢。额叶皮层通常是在异常APP代谢相关 疾病中受淀粉样蛋白斑块形成影响的脑的第一区域。
[0203] 还在相同试验中将实施例2化合物与W02006/051489的草酸盐相比（6mg/kg剂 量）。图21所示的结果表明硫酸盐较之草酸盐具有更优异的功效。
[0204] 长期处理：1个月
[0205] 向大鼠提供1或10mg/kg/天的溶于其饮用水的实施例2化合物，维持一个月。该 硫酸盐的显著高的溶解度使得其容易配制并向动物施用。一个月后处死动物，额叶皮层 (FC)和/或海马（HIP)中CTFa和CTFP的水平通过之前描述的蛋白质印迹分析来测量。 剂量依赖性结果如图22-a和22-b所示。实施例2硫酸盐通过所示的额叶皮层中的非淀粉 样原性通道通过增加CTFa的浓度而增强APP代谢（图22-a)。实施例2硫酸盐通过所示 的额叶皮层中的淀粉样原性通道通过降低CTFP的浓度而降低APP代谢（图22-b)。额叶 皮层通常是在异常APP代谢相关疾病中受淀粉样蛋白斑块形成影响的脑的第一区域，而记 忆和回忆过程中高度涉及的海马较后但严重地受到影响。因此实施例2硫酸盐对于额叶皮 层和海马中的APP代谢均具有非常积极的作用，因此可以是治疗神经退行性疾病、特别是 早期和晚期的异常APP代谢相关疾病所感兴趣的。
[0206] 长期处理：3个月
[0207] 神经病理紊乱还以Tau蛋白（AT100)的异常磷酸化为特征。Tau蛋白（在特异性 位点上）的超磷酸化可以导致阿尔茨海默病及其他Tau病变的发病机理所涉及的神经纤维 缠结（NFT)的胞内积聚。因此该研究的一条轴是研究实施例2硫酸盐对于该异常磷酸化的 作用。同时，也用应当仍未受影响的Tau蛋白（AT8)的非病理性磷酸化监控这种作用。因此 该研究的另一条轴是实施例2硫酸盐对于氧化应激（OS)的影响。因此，测定用于评价氧化 应激的一个熟知标记，即油脂的过氧化反应水平。事实上，氧化应激（OS)通过产生毒性的 活性氧簇（ROS)和氧化性损伤（至关重要的细胞组分如脂质、蛋白质和DNA的氧化）被认 为涉及神经退行性紊乱的发病机理。特别研究神经元细胞OS应答对神经变性过程的贡献。ROS产生和抗氧化剂防御之间的失衡造成0S，从而导致氧化性损伤的积聚以及最终的细胞 死亡。氧化性损伤也与帕金森病（PD)和亨廷顿氏病（HD)中的病理性神经元丧失有关。
[0208] 向4个月大的C57B16雌性小鼠提供溶于其饮用水的0.5、1或3mg/kg实施例2化 合物。首先，称重所有小鼠并分配在各笼中以使得每笼具有大约相同的平均重量土SD。将 各产品浓度在灭菌瓶中制备并避光保存于RT。每周填充饮用瓶并称重。通过每周后称重各 瓶来计算消耗的体积，并丢弃剩余体积。
[0209] 利用特异性的抗AT100抗体（抗人PHF-Tau单克隆抗体， MN1020，ThermoScientific/Pierce)通过蛋白质印迹分析（之前描述的）在脑组织上测量 AT100磷酸化水平。
[0210] 利用特异性的抗AT8抗体（抗人PHF-Tau单克隆抗体，MN1060,ThermoScientific/ Pierce)通过蛋白质印迹分析（之前描述的）在脑组织上测量AT8磷酸化水平。
[0211]LPO水平测量：海马中脂质过氧化水平以枯烯氢过氧化物（CHP)当量测定并以CHP 当量/组织湿重和改良的FOX试验后对照组数据的百分比表示。
[0212] 结果如图23-a、23_b和23-c所示。本发明硫酸盐降低病理性的Tau蛋白质磷酸 化（图23-a)，同时不影响正常的Tau蛋白质磷酸化（图23-b)。此外，该硫酸盐诱导了LPO 水平的显著减少，因此能够部分缓解氧化应激过程（图23-c)。
[0213] 根据上述实验结果，本发明硫酸盐能用于在额叶皮层和海马中使APP代谢朝向非 淀粉样原性通道。它们进一步改变病理性的Tau蛋白质磷酸化，同时缓解氧化应激过程。
【主权项】
1.N-(3- (4- (3-(二异下基氨基）丙基）赃嗦-1-基）丙基）-IH-苯并[d]咪挫-2-胺 的硫酸盐和其药学可接受的溶剂合物。2. 如权利要求1所述的硫酸盐，具有式II:其中X是0. 5-4,和其药学可接受的溶剂合物。3.如权利要求2所述的硫酸盐和其药学可接受的溶剂合物，其中X是1. 5-2. 5。4.如权利要求2所述的硫酸盐和其药学可接受的溶剂合物，其中X是0. 5-1. 5。5.如权利要求2所述的硫酸盐和其药学可接受的溶剂合物，其中X是2. 5-3. 5。6. 如权利要求2所述的硫酸盐，具有式III:其中 X如权利要求2所定义，和 y是0. 5-5。7. -种药物组合物，包含如权利要求1-6任一项所述的硫酸盐或其药学可接受的溶剂 合物，W及至少一种药学可接受的载体、稀释剂、赋形剂和/或佐剂。8. 如权利要求1-6任一项所述的硫酸盐或其药学可接受的溶剂合物用作药物。9. 如权利要求1-6任一项所述的硫酸盐或其药学可接受的溶剂合物用于治疗和/或预 防选自神经退行性疾病、淀粉样蛋白病、Tau病变和发育性疾病的疾病。10. 如权利要求9所述的硫酸盐，其中所述疾病选自阿尔茨海默病、路易体痴呆 值LB)、肌萎缩性侧索硬化（AL巧伴额颠痴呆、包涵体肌病伴佩吉特氏骨病和/或额颠痴呆 (IBMPFD)、额颠叶变性、突触核蛋白病、亨廷顿氏病、帕金森病、淀粉样蛋白血管病、额颠痴 呆伴与染色体17有关的帕金森病W及唐氏综合征。11. 如权利要求1-6任一项所述的硫酸盐或其药学可接受的溶剂合物用于在患者中延 迟选自神经退行性疾病、淀粉样蛋白病、Tau病变和发育性疾病的疾病发作。12. 如权利要求11所述的硫酸盐，其中所述疾病选自阿尔茨海默病、路易体痴呆 值LB)、肌萎缩性侧索硬化（AL巧伴额颠痴呆、包涵体肌病伴佩吉特氏骨病和/或额颠痴呆 (IBMPFD)、额颠叶变性、突触核蛋白病、亨廷顿氏病、帕金森病、淀粉样蛋白血管病、额颠痴 呆伴与染色体17有关的帕金森病W及唐氏综合征。
【专利摘要】本发明涉及N-(3-(4-(3-(二异丁基氨基)丙基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺的新型硫酸盐及其药学可接受的溶剂合物、其制备、包含其的药物组合物和其在治疗和/或预防神经退行性疾病中的用途。
【IPC分类】C07D235/30, A61P25/28, A61K31/4184
【公开号】CN105008333
【申请号】CN201380068524
【发明人】S·比莱, C·埃斯特瑞拉, M·巴里尔, P·梅尔尼克, N·塞格安特, L·比埃, P·韦瓦尔德
【申请人】雅尔兹普罗泰特公司, 国家医疗保健研究所, 法国里尔第二大学
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2013年12月27日
【公告号】CA2895285A1, EP2938597A1, WO2014102339A1