一种非梗阻性无精子症的检测试剂盒的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请是申请日为2014年9月2日、申请号为201410444435. 5、名称为一种与非 梗阻性无精子症相关的遗传标记的申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本申请涉及男性不育症检测领域，尤其涉及非梗阻性无精子症检测领域。
【背景技术】
[0003] 全球约有10% -15%的育龄夫妇面临不能生育的问题，其中一半是由于男性不 育。原发性无精子症是造成男性不育的一个非常重要的原因，约影响1%的成年男性。男 性不育发病因素具有复杂性和多样性的特点，包括疾病、营养不良、内分泌紊乱、基因缺陷 和环境因素等，其具体发病机制尚不明确，但从家族病例报道和小鼠模型的研究成果中可 以推断遗传因素起了很大作用。近年来，随着现代分子生物学技术的发展，人们已发现近 200个基因与男性不育症的发生密切相关；采用基因敲除技术，发现近400个基因与小鼠 精子发生密切相关，这些基因的突变、缺失或表达异常，可能是男性不育症发生的重要原 因。大多数基因表达异常可使青春期发育受损，随后由于下丘脑-垂体对性腺或其基因有 重要促进作用的因子缺乏，最终引起男性不育。剂量敏感的性别反转先天性肾上腺发育不 良基因 1 (Dosage-sensitivesexreversal,adrenalhypoplasiacriticalregion,on chromosomeXgene1，DAX-1)即属于下丘脑-垂体-性腺轴上的基因，其编码的蛋白是核 受体家族的成员。DAX-1作为一种转录因子对垂体促性腺细胞和肾上腺皮质的发育起非常 重要的作用。
[0004] 人类DAX-1基因位于X染色体p21，于1994年克隆成功。该基因编码的蛋白由 470个氨基酸组成，是核受体家族中的一员，主要在下丘脑、垂体、肾上腺以及性腺中表达， 对垂体促性腺细胞和肾上腺皮质的发育起非常重要的作用。越来越多的研究表明先天性 肾上腺发育不良（Adrenalhypoplasiacongenital,AHC)和低促性腺激素性性功能不全 (Hypogonadotropichypogonadism,HH)的发病与DAX-1 突变有关。由于DAX-1 基因位于 Xp上的DSS区，当该区双拷贝时常伴有46，XY男性的性反转（女性化），所以起初DAX-1被 认为是卵巢决定基因。但是，随后的条件敲除研究结果表明它在调节精子发生中起重要作 用，敲除后的雄性小鼠表现为性腺机能减退、睾丸发育异常、生精障碍等。Holter等人的研 究表明，雄激素受体（Androgenreceptor,AR)是DAX-1的一个新的作用革E1点，DAX-1通过 与AR直接相互作用抑制AR的转录活性。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种与非梗阻性无精子症相关的遗传标记。
[0006] 本发明提供一种与非梗阻性无精子症相关的遗传标记，其核苷酸序列是DAX-1基 因的序列，所述序列的突变位点选自c. 152G>A、c. 312C>G、c. 725C>T、c. 766G>C、c. 1153G>T、 c. 1279A>G和c. 162G>A中的一个或多个。
[0007] 前6个突变是错义突变，第7个突变是同义突变。
[0008] 上述突变分别是在DAX-1基因序列的第152位点、312位点、725位点、766位点、 1153位点、1279位点和162位点。
[0009] -种与非梗阻性无精子症相关的遗传标记，其核苷酸序列是DAX-1基因的序 列，所述序列的突变位点选自c. 152G>A、c. 312C>G、c. 725C>T、c. 766G>C、c. 1153G>T和 c. 1279A>G中的一个或多个。
[0010] 所述突变位点是c. 1153G>T。
[0011] 检测所述的遗传标记的引物对，选自primer1、primer2、primer3或primer4 引物对，其中，所述primer1引物对的上游引物的序列如SEQIDNO: 1所示，其下游引物的 序列如SEQIDN0:2所示；所述primer2引物对的上游引物的序列如SEQIDN0:3所示， 其下游引物的序列如SEQIDN0:4所示；所述primer3引物对的上游引物的序列如SEQID N0:5所示，其下游引物的序列如SEQIDN0:6所示；所述primer4引物对的上游引物的序 列如SEQIDN0:7所示，其下游引物的序列如SEQIDN0:8所示。
[0012] -种非梗阻性无精子症的检测试剂盒，能够特异性识别所述的遗传标记。该遗传 标志尤其是c. 1153G>T突变。
[0013] -种所述的遗传标记在制备非梗阻性无精子症检测试剂盒上的应用。
[0014] 本发明的有益效果是：通过大规模测序在非梗阻性无精子症病人中筛选出了 DAX-1基因7个新的突变位点，构建DAX-1野生型及突变体表达质粒转染到细胞内进行研 究，通过实验发现其功能有明显差异，表明DAX-1的上述突变可能导致非梗阻性无精子症 的发生，从而能够通过该突变来实现对男性不育症（尤其是非梗阻性无精子症）的诊断检 测。
【附图说明】
[0015] 图1是无精子症患者DAX-1基因的6个错义突变位点测序图谱；
[0016] 图2是免疫共沉淀检测DAX-1野生型及突变体与AR的结合的结果图；
[0017] 图3是DAX-1突变体与AR相互作用后对AR下游靶基因MMTV表达的影响的结果 图。
【具体实施方式】
[0018] 下面通过【具体实施方式】结合附图对本发明作进一步详细说明。
[0019] 1.2实验内容 [0020] 1. 2. 1标本的收集
[0021] 本申请人从2007年6月到2011年10月共收集1880例无精子症病人，其中非梗 阻性无精子症病人为776例，筛选标准为：1)随机检查三次精液中无精子；2)生殖系统或 盆腔无阻塞、炎症和损伤；3)无核型异常和Y染色体微缺失，另将706例正常可育男性（至 少育有一个孩子且未行IVF、ICSI、頂SI等人类辅助生殖技术）作为对照进行研究。每例受 试者均认真签署知情同意书，本次研究通过医院伦理委员会的审查批准。
[0022] 1. 2. 2外显子测序
[0023] 抽取外周血提取基因组DNA，用枸橼酸钠抗凝管收集研究对象的外周血，迅速置 于-80°C冰箱中备用，用QIAampDNABloodMiniKit试剂盒提取外周血DNA。
[0024] 取出5ug基因组DNA送华大基因研究中心（深圳）进行外显子捕获、测序，在非梗 阻性无精子症患者中筛选出DAX-1基因中的7个新的突变位点，其中6个错义突变和1个 同义突变，与dbSNP135数据库和千人基因组数据库中的数据相比对，均未发现此7种突变， 而在706例正常男性中也未发现这7种新的变异。
[0025] 1.2. 3验证错义突变
[0026] 以提取的外周血基因组DNA为模板，使用设计合成的4对引物对仅在非梗阻性无 精子症患者（W024,W033，W251，W505,W520，W566,W570,W628，W698)DAX-1 基因存在的 6 个 错义突变位点进行特异性扩增，DAX-1序列从NCBI数据库中查得。引物由Invitrogen公司 合成，所合成的4种引物见表1。DAX-1基因在NCBI数据库中的编号是GeneID:190。采用 primer1引物对的PCR产物的序列如SEQIDNO: 23所示；采用primer2引物对的PCR产 物的序列如SEQIDN0:24所示；采用primer3引物对的PCR产物的序列如SEQIDN0:25 所示；采用primer4引物对的PCR产物的序列如SEQIDNO: 26所示。
[0027] 表1DAX-1点突变验证引物
[0028]
[0029]PCR扩增条件为：98°C预变性 2min，然后以 98°C10s、60°C30s、72°C45s进行 35 个 循环，最后72°C延伸5min。
[0030]DNA电泳：取3y1PCR产物在1 %琼脂糖凝胶孔中，140V电泳，15min，紫外凝胶成 像系统拍照观察电泳图，确保单一条带，其余PCR产物送上海英潍捷基公司测序。
[0031] 1.2. 4质粒构建
[0032] 1. 2. 4. 1DAX-1野生型表达质粒的构建
[0033] 1. 2. 4. 1. 1人DAX-1基因cDNA编码区全长序列的获取
[0034] 将人睾丸组织RNA逆转录合成cDNA，并以此为模板，设计含有Hind III和BamHl两 种限制性酶切位点的引