2G>A(p.L54L)，前 6 个位错义突变，最后 1个为同义突变，与dbSNP135数据库和千人基因组数据库中的数据相比对，均未发现有这 些突变，而在706例正常可育男性中也未发现这些新的变异（如表3所示）。进一步的PCR 验证错义突变的结果如图1所示。
[0084] 表3DAX-1点突变在非梗阻性无精子症组和正常组中的情况
[0085]
[0086] 注：病人编号以W开头，仅编号7为同义突变。
[0087] 2. 2DAX-1野生型及突变体与AR在细胞内的结合作用
[0088] 为了进一步检测DAX-1突变后与AR的相互作用情况，采用免疫共沉淀技术，在 HeLa细胞中分别共转入hAR和DAX-1野生型及突变体表达质粒，转染48h后收集细胞提取 总蛋白，做anti-AR和anti-HA的免疫共沉淀以及anti-AR和anti-HA的WesternBlot检 测蛋白的相互作用和表达情况，结果显示与DAX-1野生型相比，仅DAX-1V385L突变体与AR 的结合减弱。
[0089] 2. 3DAX-1突变体与AR相互作用后对AR下游靶基因MMTV表达的影响
[0090] DAX-1作为辅因子与AR相互作用来调控下游基因的表达，为了进一步检测DAX-1 6种突变体与AR相互作用后对AR下游靶基因MMTV表达的影响，采用双荧光素酶报告 基因实验，将AR表达质粒和MMTV-LUC与DAX-1野生型及6种突变体质粒分别共转染 到HeLa细胞中，由于AR属于配体依赖性转录因子，因此转染后用雄激素进行处理，将检 测到的萤火虫荧光值/海参荧光值来表示启动子的活性。与野生型DAX-1-致，DAX-1 R51K,C104W,A242V,E256Q,I427V突变体也可以明显抑制MMTV启动子的活性，仅DAX-1 V385L突变体与野生型有显著差异，不能抑制MMTV启动子的活性，如图3所示。
[0091] 3 讨论
[0092] DAX-1基因突变主要表现为肾上腺皮质发育不全，伴或不伴有低促性腺激素性性 腺功能减退。由于多数患者首发症状典型，确诊并不容易。DAX-1基因为孤儿核受体，在肾上 腺皮质、性腺、下丘脑和垂体中表达。DAX-1基因含2个外显子，共编码470个氨基酸。1994 年Muscatelli等首次报道DAX-1单基因突变与AHC和HH突变有关，上海瑞金医院2007年 在国内首次报道了此病患者。DAX-1基因突变类型的发生频率依次为单独或伴有邻近基因 共同缺失（约40% )、移码突变（约28% )、无义突变（约18% )和错义突变（约14% )。 多数突变位点位于推测的配体结合区域，致使其转录功能受损。本实验研究发现7个DAX-1 基因点突变中有6个为错义突变，1个为同义突变，且与dbSNP135数据库和千人基因组数据 库中的数据相比对，均未发现有这些突变。Holter等人的研究表明，雄激素受体AR是DAX-1 的一个新的作用靶点，DAX-1通过与AR直接相互作用抑制AR的转录活性。本实验通过构 建DAX-1野生型及突变体表达质粒，研究DAX-1在细胞中的功能。通过测序结果及功能研 究分析DAX-1野生型及突变体表达质粒构建成功，DAX-1V385L突变体的功能与DAX-1野 生型相比有显著性差异。
[0093] DAX-1在下丘脑、垂体、肾上腺和性腺等组织中均有表达。免疫组化证实：从第 11. 5天开始，DAX-1在胚鼠前脑中表达，第13. 5天在垂体前叶中表达，第14. 5天在间脑腹 侧表达，第18天在丘脑下部的腹内侧核中表达。且研究证实小鼠性腺发育的不同时期均 有DAX-1的表达：从第9天胚鼠出现尿生殖嵴时开始表达DAX-1 ;性别分化后，在雄性小鼠 睾丸中DAX-1的水平先迅速下降，然后逐渐升高，第12天在Sertoli细胞和Leydig细胞中 达到高峰，推测DAX-1在睾丸发育晚期可能具有调控雄性特异性基因的作用；但在雌性小 鼠中则不同，第13. 5天时性腺中仍有表达，并持续到成年，但作用不详。人DAX-1基因位于 Xp21，人与鼠DAX-1基因同源性为65%。它是不典型的孤核受体家族成员，缺乏DNA结合 域，在脊椎动物孤核受体家族中属于第〇类。DAX-1也有一个保守的LBD，它的N端重叠区 是一个锌指的保守序列，可与DNA上的发夹结构结合。核受体通常均有保守的LBD，通过与 配体结合可激活核受体的靶基因。DAX-1可能是进化过程中出现较早的核受体家族，在演变 过程中LBD发生突变，失去与配体结合的能力，因此虽然DAX-1有LBD，但目前尚未找到它的 配体。
[0094] 本实验通过对临床资料的收集，利用大规模测序技术在非梗阻性无精子症病人中 筛选DAX-1基因的突变位点，功能试验结果显示DAX-1V385L突变体及DAX-1野生型在细 胞内的功能有显著差异，提示这个突变位点与非梗阻性无精症的发生存在相关性，DAX-1可 能是临床男性不育一个潜在的诊疗靶点。
[0095] 4 结论
[0096] 4. 1通过大规模测序筛选出仅在非梗阻性无精子症患者中DAX-1基因的6个错义 突变，其相应的氨基酸改变为：R51K、C104W、A242V、E256Q、V385L、I427V，与dbSNP135数据 库和千人基因组数据库中的数据相比对，均未发现有这些突变。
[0097] 4. 2DAX-1野生型及DAX-1V385L突变体与AR在细胞内的结合作用有显著差异。
[0098] 4. 3DAX-1V385L突变体与AR相互作用后对AR下游靶基因MMTV的表达与DAX-1 野生型相比有显著性差异。
[0099] 以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发 明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱 离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。
【主权项】
1. 一种非梗阻性无精子症的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测与非梗阻 性无精子症相关的遗传标记的引物对，所述遗传标记的核苷酸序列是DAX-I基因的序列， 所述序列的突变位点选自 c.152 G>A、c.312 OG、c.725 OT、c.766 G>C、c.ll53 G>T、 c. 1279 A>G和c. 162 G>A中的一个或多个；所述引物对，选自primer Uprimer 2、primer 3或primer 4引物对，其中， 所述primer 1引物对的上游引物的序列如SEQ ID N0:1所示，其下游引物的序列如 SEQ ID NO:2 所示； 所述primer 2引物对的上游引物的序列如SEQ ID N0:3所示，其下游引物的序列如 SEQ ID NO:4 所示； 所述primer 3引物对的上游引物的序列如SEQ ID N0:5所示，其下游引物的序列如 SEQ ID NO:6 所示； 所述primer 4引物对的上游引物的序列如SEQ ID N0:7所示，其下游引物的序列如 SEQ ID NO:8 所示。2. 根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述遗传标记的核苷酸序列是 DAX-I基因的序列，所述序列的突变位点选自c. 152 G>A、c. 312 OG、c. 725 OT、c. 766 G>C、c. 1153 G>T 和 c. 1279 A>G 中的一个或多个。3. 根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述突变位点是c. 1153 G>T。
【专利摘要】本发明公开了一种非梗阻性无精子症的检测试剂盒，包括检测与非梗阻性无精子症相关的遗传标记的引物对，遗传标记的核苷酸序列是DAX-1基因的序列，所述序列的突变位点选自c.152？G>A、c.312？C>G？、c.725？C>T？、c.766？G>C？、c.1153？G>T、c.1279？A>G和c.162？G>A中的一个或多个；所述引物对选自primer？1、primer？2、？primer？3或primer？4引物对。通过大规模测序在非梗阻性无精子症病人中筛选出了DAX-1基因7个新的突变位点，研究表明DAX-1的上述突变可能导致非梗阻性无精子症的发生，从而能够通过使用本发明的试剂盒检测该突变来实现对男性不育症(尤其是非梗阻性无精子症)的诊断检测。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105112501
【申请号】CN201510366368
【发明人】牟丽莎, 蔡志明
【申请人】深圳市第二人民医院
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2014年9月2日
【公告号】CN104531683A