物，以3'带HA多肽标签的pcDNA3. 1 (+)为载体，构建野生型DAX-1 表达质粒。带有酶切位点的引物序列为：
[0035]上游：5,-CCCAAGCTTATGGCGGGCGAGAAC-3,（SEQIDN0:9)
[0036]下游：5，-CGCGGATCCCGTATCTTTGTACAG-3,（SEQIDN0:10)
[0037] 其中上游引物5'端含有HindIII酶切位点，下游引物5'端含有BamHl酶切位点。
[0038] 1. 2. 4. 2DAX-1突变体表达质粒的构建：
[0039] 以测序正确的pcDNA3. 1-DAX1为模板，使用设计合成的6对点突变引物，构建 DAX-1 6种突变体表达质粒。引物由Invitrogen公司合成，所合成的6对引物见表2。
[0040] 表2DAX-1 6对定点突变引物 [0041 ]
[0043] 1. 2. 5双荧光素酶报告基因实验
[0044] 1. 2. 5. 2质粒准备
[0045]野生型DAX-1表达载体：pcDNA3. 1-DAX-l WT (WT组）
[0046]突变型DAX-1 表达载体：pcDNA3. 1-DAX-lR51K(R51K组）
[0047] pcDNA3. 1-DAX-l C104W(C104W 组）
[0048]pcDNA3. 1-DAX-lA242V(A242V 组）
[0049]pcDNA3. 1-DAX-lE256Q(E256Q 组）
[0050]pcDNA3. 1-DAX-lV385L(V385L 组）
[0051]pcDNA3. 1-DAX-lI427V(I427V 组）
[0052] 1. 2. 5. 3HeLa细胞培养
[0053] 将HeLa细胞用含10%胎牛血清DMEM培养基在37°C、5%C02和95%湿度条件下 培养。贴壁细胞在长满瓶底时，用〇. 25%胰蛋白酶消化后按比例进行传代培养。
[0054] 1. 2. 5. 4HeLa细胞瞬时转染
[0055] 将HeLa细胞接种于24孔板，待细胞贴壁后进行转染，方法参考转染试剂 Lipofectamine? 2000说明书。转染6h后，用移液枪吸弃每孔培养液，每孔再加入新的1640 培养基500y1，减少Lipofectamine2000对细胞的毒性。
[0056] 1. 2. 5. 5双荧光素酶报告系统检测转录因子活性
[0057] 1)转染24h后收集细胞，用移液枪吸弃每孔培养液，每孔加入PBS 1ml洗涤2次；
[0058]2)将 5XPassive Lysis Buffer稀释成 1XPassive Lysis Buffer，用移液枪向 每孔加入 100y1Passive Lysis Buffer;
[0059] 3)室温下在摇床上裂解细胞15min，用微量移液枪分别吸取每孔细胞裂解液5y1 至一个干净的1. 5mL透明EP中；
[0060]4)在避光环境中依次向每个EP管中加入19 u 1 Luciferase Assay II Buffer后 用单管光度计检测萤火虫荧光照度；
[0061] 5)在避光环境中依次再向每个EP管中加入19y1STOPBuffer后用单管光度计 检测海肾荧光照度，以萤火虫荧光来校正海肾荧光减少实验误差。测定报告基因的相对活 性。
[0062]1. 2. 6免疫共沉淀实验
[0063]1. 2. 6. 2质粒准备
[0064]人AR表达质粒：pcDNA3. 1-AR
[0065]野生型DAX-1表达载体：pcDNA3. 1-DAX-l WT (WT组）
[0066]突变型DAX-1 表达载体：pcDNA3. 1-DAX-lR51K(R51K组）
[0067] pcDNA3. 1-DAX-l C104W(C104W 组）
[0068]pcDNA3. 1-DAX-lA242V(A242V 组）
[0069]pcDNA3. 1-DAX-lE256Q(E256Q 组）
[0070]pcDNA3. 1-DAX-lV385L(V385L 组）
[0071]pcDNA3. 1-DAX-lI427V(I427V 组）
[0072] 1. 2. 6. 3HeLa细胞培养
[0073] 将HeLa细胞用含10%胎牛血清高糖DMEM培养基在37°C、5%C02和95%湿度条 件下培养。贴壁细胞在长满瓶底时，用〇. 25%胰蛋白酶消化后按比例进行传代培养。
[0074] 1. 2. 6. 4细胞总蛋白的提取
[0075] 用含有10%胎牛血清的DMEM完全培养基培养HeLa细胞，放置于37°C、5%C02的 培养箱中，按照无菌操作台内的常规细胞培养方法培养。将处于对数生长期的HeLa细胞 以3X105/孔密度接种于6孔培养板，待第二天细胞贴壁后，根据转染试剂Lipofectamine? 2000的转染步骤，将重组质粒pcDNA3. 1(+)-3'HA-DAX1WT及6种突变体mutl-mut6(实验 组，2ug)和pcDNA3. 1 (+) -3 ^HA空载（对照组，2ug)与hAR的表达载体（2ug)分别共转染到 HeLa细胞。转染48h后吸弃培养基，根据Qiagene公司的哺乳动物蛋白提取试剂盒的提取 步骤用1XPBS溶液洗涤2次，加入lml预冷的PBS用细胞刮轻轻挂下，转移到1. 5ml的Ep 管，450Xg，4°C离心 5min，弃掉上清置于冰上，用 100ulLysisBuffer(含 0.1UBenzonase Nuclease,lullOOXProteaseInhibitor)重悬沉淀，4°C旋转 5min后，14,OOOXgJC离 心10min，将上清转移至新的离心管中。
[0076] 1. 2. 6. 5免疫共沉淀
[0077] 将实验组与对照组提取的蛋白平均分成4分，其中一份作为Input样品，加入 6.25ul的 5XSDSLoadingBuffer(含 5%lmMDTT)，混匀后 98°C处理 10min，-80°C保 存。余下3份上清液均加入475ul的LysisBuffer或Co-IPBuffer，补充至每管总体积为 500ul，之后分别加入2ugAR抗体，2ugHA抗体，2ugIgG;4°C旋转lh;每管加入50ul预处 理后的ProteinA/GBeads4°C旋转过夜。
[0078] 4°(：旋转过夜后12,000\8,4°(：瞬时离心208，弃上清；加入600111 1^818811打6『 重悬，12, 000Xg，4°C离心lmin洗涤Beads(不用枪头吸，用手弹起即可），共洗涤3次，用 枪吸出上清，但不要吸干，注意不能吸到Beads;向Beads中加入15ul的LysisBuffer和 等体积2XSDS上样缓冲液，混匀后98°C处理10min，将蛋白即抗原抗体复合物从Beads上解 离下来，即可用于蛋白电泳。制备SDS聚丙烯酰胺凝胶，每孔上样量15ul，常规电泳后将蛋 白转移至硝酸纤维素膜上，用含有5%脱脂奶粉的TBS-T缓冲液（0.02MTris-Cl，pH7.6, 0. 137MNaCl，0. 1%Tween-20)室温封闭1小时后，弃去封闭液。加入一定量适当稀释于含 5%脱脂奶粉的TBS-T缓冲液中的识别目的蛋白的一抗（鼠抗人HA和兔抗人AR单克隆抗 体，1:2000稀释），4°C过夜；弃去一抗，TBS-T缓冲液清洗3次，每次5分钟。加入一定量适 当稀释于含5%脱脂奶粉的TBS-T缓冲液中的二抗（1:10000稀释），室温孵育1小时；弃去 二抗，TBS-T缓冲液清洗3次，每次5分钟。在膜上滴加ECL化学发光底物，然后用X光片 曝光，经冲片机自动显影定影。
[0079]L2. 7统计学分析
[0080] 所用统计学方法来自于SPSS17.0软件，每组数据以均数土标准差()表示， 组间均值的比较采用独立样本t检验，P〈0. 05为有统计学意义。
[0081] 2实验结果
[0082] 2. 1非梗阻性无精子症患者DAX-1基因点突变的鉴定
[0083] 对776例非梗阻性无精子症患者和706例正常可育男性的DAX-1基因的外显 子测序结果分析，如表3所示：DAX-1基因的7个新突变均为纯合突变，突变位点分别 为：c. 152G>A(p.R51K)、c. 312C>G(p.C104W)、c. 725C>T(p.A242V)、c. 766G>C(p.E256Q)、 c. 1153G>T(p.V385L)、c. 1279A>G(p.I427V)和c. 16