含脂质运载蛋白融合伴侣的制作方法
【专利说明】含脂质运载蛋白融合伴侣
[0001] 关于联邦资助研究的声明
[0002] 本发明是在美国政府的支撑下依据国家卫生研究院合同号R01CA13549UNIHR0I AI059543、AI094419 和AI097786 而完成。
[000引发明背景
[0004] 在药物发现方面的努力继续使用巨大的技术和财政资源来鉴别和开发新的和适 用的药物。不幸的是，发现新药一直是困难的。例如，开发损伤性小（更确切地说祀向癌 症）的疗法是有必要的。但即使研究了数十年，科学家仍在努力鉴别具有医药和癌症祀向 性质的正确混合的治疗化合物，其不仅降低了治疗化合物可充当治疗策略的可能性，而且 对成功的手术切除法产生需要。
[0005] 已经研究了广泛的多种类型的化合物并且将其从事于众多治疗目的。例如，小的 化学分子和较大生物制剂（例如抗体）已经用于大量治疗应用中，取得了不同的成功。也 已经显示一些较小的肤例如因其天然的效力而适用作药物。
[0006] 缺少快速并有效地制造用于临床应用的肤和蛋白质的方法已经限制了可W充当 治疗化合物的肤和蛋白质的发现。已经在细菌表达系统（例如大肠杆菌巧.Coli)基因表 达）中探索了产生肤、蛋白质结构域或蛋白质与不同蛋白质的融合物W增强肤和蛋白质的 产生。然而，细菌蛋白表达系统一般因蛋白质折叠效率误差而受限。因此，仍需要可快速并 有效地产生肤、蛋白质结构域和蛋白质的方法。
[0007] 发明概述
[0008] 本发明设及产生隧铁蛋白（siderocalin)融合蛋白的方法。在各个方面，本发明 设及根据那些方法产生的融合蛋白。在某些方面，融合蛋白被裂解，从而产生根据本公开的 肤。本发明还设及产生融合蛋白的方法，所述方法包括在细胞中表达融合蛋白，所述融合蛋 白包含肤或蛋白质结构域和脂质运载蛋白，从而产生融合蛋白。在一些实施方案中，本发明 还设及一种产生肤的方法，所述方法包括：在细胞中表达包含肤和脂质运载蛋白的融合蛋 白；W及从脂质运载蛋白分离肤，从而产生肤。
[0009] 在一些实施方案中，本发明设及融合蛋白的组合物，所述组合物包含：肤或蛋白质 结构域；W及脂质运载蛋白。在一些实施方案中，本发明还设及一种包含肤文库的组合物， 所述肤文库还包含多种缺乏至少一个天然赖氨酸残基的肤。本发明还设及一种组合物，其 包含：包含肤和脂质运载蛋白的融合蛋白。
[0010] W引用的方式并入
[0011] 本说明书中提及的所有出版物、专利及专利申请都W引用的方式并入本文中，其 引用程度如同每一个别出版物、专利或专利申请被特定地且个别地表明W引用的方式被并 入一样。
[0012] 附图简述
[0013] 在随附权利要求书中特别地示出了本发明的新颖特征。将通过参考W下阐述说明 性实施方案（其中利用了本发明的原理）的详细描述，W及随附图式来获得对本发明的特 征和优势的更好理解，在所述图式中：
[0014] 图1提供了示出根据本发明的一个实施方案的多种支架的凝胶图像。
[0015] 图2示出了根据本发明的一个实施方案产生肤文库的实例方法。
[0016] 图3描绘了根据本发明的一个实施方案可用W制备打结素（knottin)(例如气泡 蛋白）的实例融合系统。
[0017] 图4示出了根据本发明的一个实施方案使用质谱对大的肤文库的分析。
[0018] 图5示出了根据本发明的一个实施方案使用隧铁蛋白融合物W表达打结素变体 的实例方法。
[0019] 图6描绘了根据本发明的实施方案对表达性打结素支架的SDS-PAGE分析。
[0020] 图7提供了根据本发明的一个实施方案的汇集文库产生的示意图。图7B示出了 图7A的透视图。
[0021] 图8描述了根据本发明的一个实施方案来自克隆的打结素文库的代表性测序数 据。
[0022] 图9示出了根据本发明的实施方案对3000个成员的打结素文库的SDS-PAGE分 析。
[0023] 图10示出了根据本公开的一个方面制造打结素的一般过程。
[0024] 图11示出了根据本公开的一个方面制造打结素的一般过程。
[00巧]图12示出了根据本公开的一个方面制造打结素的一般过程。根据运个方面，裂解 出现在弗林蛋白酶-打结素交界面。
[0026] 图13示出了根据本公开的一个方面用代达罗斯系统值aedalussystem)制备的 打结素的实例和相应的SDSPAGE分析。代达罗斯系统描述于BandaranayakeA.化等， NucleicAcidsRes. (2011)39(21) :el43 中。
[0027] 图14示出了来自18个物种的Sen序列的比对。所述比对示出了在18个具有可 识别的直系同源体的物种之间高水平的序列保守性。星号位置是用于配体结合的可能位 点。Correnti，C.和Strong，R.K. (2013)'Ironsequestrationinimmunity'在Metals inCelIs中;Encvclopedi曰ofInorg曰nic曰ndBioinorg曰nicChemistry. (Culotta，V.和 Scott,R.A.，编.）JohnWiley&Sons，第：M9-59 页。
[0028] 图15描绘了根据本公开的一个方面的超稳定Sen的3D模型。在运种形式的Sen 中，将第二个二硫键工程化W保护N末端并且提高热稳定性。
[0029] 图16示出了可用于本公开的各个方面的一般Sen融合物的示意图。除去天然信 号肤并且增加外源性sFLAG和HIS标签W帮助纯化。运些修饰任选地存在于本公开的各个 方面。
[0030] 图17描绘了根据本公开的一个方面轻链抗体与Sen的融合物和相应的SDSPAGE 分析的示意图。
[0031] 图18示出了根据本公开的一个方面比较Sen与胞质酶HM0X1的融合物的表达在 裂解前后的SDSPAGE分析。
[0032] 图19描绘了根据本公开的一个方面Sen与细胞质病毒蛋白质Adv2的融合物的表 达W及相应的SDSPAGE分析。
[0033] 图20描绘了根据本公开的一个方面Sen与细胞外病毒糖蛋白HIV甜120的融合 物的表达W及相应的SDSPAGE分析。
[0034] 图21描绘了根据本公开的一个方面Sen与打结素蛋白欧前胡素的融合物的表达 W及相应的SDSPAGE分析。
[0035] 图22描绘了根据本公开的一个方面Sen与细胞外酪氨酸激酶受体R0R1的小的亚 结构域（即=环域）的融合物的表达W及相应的SDSPAGE分析。
[0036] 图23描绘了根据本公开的一个方面Sen与屯聚体W及=聚体亚结构域的融合物 的表达W及相应的SDSPAGE分析。
[0037] 图24描绘了根据本公开的一个方面ExFABP与打结素的融合物的表达W及相应 SDSPAGE分析。ExFABP是另一功能性Sen。根据本公开，运种构建体可用于周质细菌系统 W分泌多种客户蛋白。
[0038] 图25描绘了具有化配体的Sen的晶体结构。
[0039] 图26描绘了捕获的巧光铁载体。左框描绘了蛋白质铁载体络合物的尺寸排阻纯 化。右框是不意图。
[0040] 发明详述
[0041] 本公开的方法和系统设及融合蛋白和其制造方法。根据某些方面，使用本发明的 方法产生的肤可用作药物发现平台的组分。在一些方面，所述方法设及产生具有潜在治疗 价值的第一蛋白质或肤与第二蛋白质的融合物，W使第二蛋白质增强表达系统对第一蛋白 质的产生和折叠。在一些方面，在表达和纯化融合蛋白之后，融合蛋白裂解，W使第一蛋白 质和第二蛋白质为独立蛋白质。在一些方面，第二蛋白质可为脂质运载蛋白。例如，第二蛋 白质可为特异性脂质运载蛋白，如隧铁蛋白。
[0042] 缀合物
[0043] 在一些方面，本发明包括如本文所述的融合蛋白、肤或其缀合物。例如，一些或所 有融合蛋白或肤可缀合于选择W修饰肤性质的部分。
[0044] 在某些方面，本发明包括在N末端缀合于疏水性（例如亲脂性）部分的融合蛋白 或肤。所有或一些本公开的融合蛋白或肤可缺乏内部赖氨酸，例如W避免在内部赖氨酸位 置的缀合，从而允许缀合于肤的氨基端。在一些实施方案中，疏水部分连接于N末端可用W 延长本公开的融合蛋白或肤的半衰期。在一些实施方案中，简单碳链（例如通过肉違酷化 和/或栋桐酷化）可缀合于融合蛋白或肤。在一些方面，简单碳链可使融合蛋白或肤从非 缀合物容易地分离。例如，可用于从非缀合物分离融合蛋白或肤的方法包括但不限于溶剂 萃取和反相色谱法。亲脂部分可通过可逆地结合于血清白蛋白来延长半衰期。在某些实施 方案中，也可将近红外染料连接于融合蛋白或肤的N末端W允许追踪所缀合的融合蛋白或 肤。在某些实施方案中，也可将近红外染料连接于肤的赖氨酸W允许追踪所缀合的肤。染 料的抗体可进一步允许染料填补追踪标记与收回手柄的双重作用。缀合的融合蛋白或肤也 可W缀合于可起到其它作用的其它部分，所述其它作用如为从组织或液体收回肤提供亲和 手柄（例如生物素）。
[0045] 可使用其它修饰。例如，融合蛋白、肤或其缀合物可包括翻译后修饰（例如甲基化 和/或酷胺化）。在一些实施方案中，本公开的融合蛋白或肤可缀合于例如可修饰肤或实 现其性质变化的其它部分。缀合部分可为例如通过可逆地结合于血清白蛋白来延长肤半衰 期的亲脂部分。在一些实施方案中，亲脂部分可为胆固醇或胆固醇衍生物，包括胆酱締、胆 酱烧、胆酱二締和氧固醇（oxysterol)。在一些实施方案中，肤可缀合于肉豆違酸（十四烧 酸）或其衍生物。
[0046] 在一些实施方案中，本公开的融合蛋白或肤可缀合于可检测标记W可追踪检测或 可视化缀合肤的生物分布。可检测标记可为巧光标记（例如巧光染料）。在某些实施方案 中，巧光标记可具有具体应用所需的发射特征。例如，巧光标记可为最大发射波长在W下范 围之间的巧光染料：500nm至 1100nm、600nm至 1000nm、600 至 800nm、650nm至 850nm、700nm 至800nm、720至780nm，或720至750nm。例如，在一定条件下，花菁5. 5的最大发射可为约 695nm、IRdye800的最大发射可为约800nm，并且吗I噪菁绿的最大发射可为约820nm。本领 域的普通技术人员将了解可用作可检测标记并且具有上述发射特征的各种染料。
[0047] 如本文所用，术语"可检测标记"意指可连接于小的化学分子、肤、蛋白质或其片段 或部分的标签或修饰，W使所述小的化学分子、肤、蛋白质或其片段或部分可使用允许检测 所述标签或修饰的装置、设备或方法识别。
[0048] 在一些方面，可检测标记是巧光染料。可在本公开中用作缀合分子的巧光染料的 非限制性实例包括若丹明、对甲氨基酪、巧光素、硫基巧光素、氨基巧光素、簇基巧光素、氯 巧光素、甲基巧光素、横基巧光素、氨基对甲氨基酪、簇基对甲氨基酪、氯对甲氨基酪、甲基 对甲氨基酪、横基对甲氨基酪；氨基若丹明、簇基若丹明、氯若丹明、甲基若丹明、横基若丹 明和硫基若丹明、花菁、吗I噪幾花菁、氧杂幾花菁、硫杂幾花菁、部花菁、花菁染料（例如花 菁2、花菁3、花菁3. 5、花菁5、花菁5. 5、花菁7)、嗯二挫衍生物、化晚基嗯挫、硝基苯并嗯 二挫、苯并嗯二挫、巧衍生物、级联蓝、嗯嗦衍生物、尼罗红（Nilered)、尼罗蓝、甲酪紫、嗯 嗦170、叮晚衍生物、原黄素、叮晚澄、叮晚黄、芳基次甲基衍生物、氧杂蔥染料、横化氧杂蔥 染料、AlexaFluor(例如AlexaFluor594、AlexaFluor633、AlexaFluor647、Alexa Fluor700)、金胺、结晶紫、孔雀绿、四化咯衍生物、化嘟、献花菁和胆红素。在一些实施方 案中，染料可为近红外染料，包括例如切5. 5、IRdye800、DyLi曲t750或吗I噪菁绿（ICG)。 在一些实施方案中，近红外染料可包括花菁染料（例如花菁2、花菁3、花菁3. 5、花菁5、花 菁5. 5、花菁7)。在某些实施方案中，可检测标记可包括氧杂蔥染料或横化氧杂蔥染料，如 AlexaFluors(例女日AlexaFluor594、AlexaFluor633、AlexaFluor647、AlexaFluor 700)。如果可找到染料的抗体，那么可将缀合染料用作追踪、检测或可视化标记和收回手 柄。
[0049] 本发明的融合蛋白或肤也可W缀合于生物素。除延长半衰期W外，生物素也可W 充当亲和手柄W从组织或其它位置收回肤。在一个实施方案中，肤可用PEG连接子（例如 NHS-dPEG4-生物素酶化iotinidase)抗性生物素）缀合于例如生物素酶抗性生物素。在 一些实施方案中，可使用可用作可检测标记与亲和手柄的巧光生物素缀合物。市售巧光 生物素缀合物的非限制性实例包括Atto425-生物素、Atto488-生物素、Atto520-生 物素、Atto-550生物素、Atto565-生物素、Atto590-生物素、Atto610-生物素、Atto 620-生物素、Atto655-生物素、Atto680-生物素、Atto700-生物素、Atto725-生物素、 Atto740-生物素、巧光素生物素、生物素-4-巧光素、生物素-(5-巧光素）缀合物，和生物 素-B-藻红素、alexafluor488 生物胞素、alexaflour546、alexafluor549、巧光黄尸 胺生物素-X、巧光黄生物胞素、俄勒冈绿（化egongreen) 488生物胞素、生物素-若丹明和 四甲基若丹明生物胞素。在一些其它实例中，缀合物可包括化学发光化合物、胶态金属、发 光化合物、酶、放射性同位素和顺磁性标记。
[0050] 在一些方面，本发明的融合蛋白和肤可缀合于维生素或通常见于食物的从胃、小 肠或结肠吸收到血流中的其它分子。实例包括但不限于维生素A、维生素C、维生素B2、维生 素B3、维生素Be、维生素Bi2、维生素D、维生素E、维生素K。运些缀合的目标是提高口服生物 利用率或自胃肠系统的肤的吸收。