[0051] 在一些情况下，可鉴别似乎帮助某些肤穿过生物屏障如胃肠道、血脑屏障、细胞 膜、核膜的所选氨基酸系列，并且可将其W遗传或物理方式移植到其它肤上W达到帮助新 的肤穿过相同生物屏障的目的。在其它情况下，相同方法可用于将序列移植到肤上，其将防 止新的肤穿过某些生物屏障。例如，可W此方式修饰药物W防止BBB穿透并因此降低中枢 神经系统副作用的可能性。
[0052] 在某些实施方案中，巧光标记可具有具体应用所需的发射特征。例如，巧光标记 可为最大发射波长在W下范围之间的巧光染料：500皿至1100皿、600皿至1000皿、600至 800nm、650nm至 850nm、700nm至 800nm、720 至 780nm，或 720 至 750nm。本领域的普通技术 人员将了解可用作可检测标记并且具有上述发射特征的各种染料。例如，在一定条件下，花 菁5. 5的最大发射可为约695nm、IRdye的最大发射可为约800nm，并且吗I噪菁绿的最大发 射可为约820nm。
[0053] 可在本公开中用作缀合分子的巧光染料的非限制性实例包括若丹明、对甲氨基 酪、巧光素、硫基巧光素、氨基巧光素、簇基巧光素、氯巧光素、甲基巧光素、横基巧光素、氨 基对甲氨基酪、簇基对甲氨基酪、氯对甲氨基酪、甲基对甲氨基酪、横基对甲氨基酪；氨基 若丹明、簇基若丹明、氯若丹明、甲基若丹明、横基若丹明和硫基若丹明、花菁、吗I噪幾花菁、 氧杂幾花菁、硫杂幾花菁、部花菁、嗯二挫衍生物、化晚基嗯挫、硝基苯并嗯二挫、苯并嗯二 挫、巧衍生物、级联蓝、嗯嗦衍生物、尼罗红、尼罗蓝、甲酪紫、嗯嗦170、叮晚衍生物、原黄素、 叮晚澄、叮晚黄、芳基次甲基衍生物、金胺、结晶紫、孔雀绿、四化咯衍生物、化嘟、献花菁和 胆红素。在一些实施方案中，可检测标记可包括近红外染料，如但不限于切5.5、吗I噪菁绿 (ICG)、DyLi曲t750或IRdye800。在一些实施方案中，近红外染料可包括花菁染料（例 如花菁2、花菁3、花菁3. 5、花菁5、花菁5. 5、花菁7)。在某些实施方案中，可检测标记可包 括氧杂蔥染料或横化氧杂蔥染料，如AlexaFluors(例如AlexaFluor594、AlexaFluor 633、AlexaFluor647、AlexaFluor700)。另外，如果可鉴别染料的抗体，那么可将缀合染 料用作追踪、检测或可视化标记W及收回手柄。
[0054] 可使用对本公开的融合蛋白、肤或其缀合物的其它修饰。例如，本公开的融合蛋白 或肤可包括翻译后修饰（例如甲基化和/或酷胺化），其可影响例如血清半衰期。在一些实 施方案中，所述融合蛋白或肤可缀合于例如可修饰肤或实现其性质变化的其它部分。缀合 部分可为例如通过可逆地结合于血清白蛋白来延长肤半衰期的亲脂部分。在一些实施方案 中，简单碳链（例如通过肉違酷化）可缀合于肤。在一些实施方案中，亲脂部分可为胆固醇 或胆固醇衍生物，包括胆酱締、胆酱烧、胆酱二締和氧固醇。在一些实施方案中，肤可缀合于 肉豆違酸（十四烧酸）或其衍生物。
[0055] 本公开的融合蛋白或肤也可W缀合于可起到其它作用的其它部分，所述其它作用 如为从组织或液体收回肤提供亲和手柄（例如生物素）。例如，本发明的肤也可W缀合于 生物素。除延长半衰期W外，生物素也可W充当亲和手柄W从组织或其它位置收回肤。在 一些实施方案中，可使用可用作可检测标记与亲和手柄的巧光生物素缀合物。市售巧光 生物素缀合物的非限制性实例包括Atto425-生物素、Atto488-生物素、Atto520-生 物素、Atto-550生物素、Atto565-生物素、Atto590-生物素、Atto610-生物素、Atto 620-生物素、Atto655-生物素、Atto680-生物素、Atto700-生物素、Atto725-生物素、 Atto740-生物素、巧光素生物素、生物素-4-巧光素、生物素-(5-巧光素）缀合物和生物 素-B-藻红素、Alexafluor488 生物胞素、Alexaflour546、AlexaFluor549、巧光黄尸 胺生物素-X、巧光黄生物胞素、俄勒冈绿488生物胞素、生物素-若丹明和四甲基若丹明生 物胞素。在一些其它实例中，缀合物可包括化学发光化合物、胶态金属、发光化合物、酶、放 射性同位素和顺磁性标记。
[0056] 制备融合蛋白和肤的方法
[0057] 在又一方面，本发明包括制备根据本公开的融合蛋白或肤的方法。
[0058] 在一些实施方案中，本发明包括制备根据本公开的融合蛋白或肤的方法。如本文 进一步所述，本发明包括可用作产生根据本公开的融合蛋白或肤的起点的支架。可使用几 种不同方法来制备运些支架W及大量支架变体。在一些方面，可使用本领域一般熟知的肤 合成技术来产生根据本公开的融合蛋白或肤。也可W使用常规寡核巧酸合成技术（例如基 于忍片的寡核巧酸合成）。在一些情况下，合成方法可与多种表达系统组合。在一个实例实 施方案中，可祀向支架中的具体残基位置W使用简并密码子进行随机诱变W产生不同DNA 组，所述DNA组可使用例如基于忍片的寡核巧酸合成来制备并且可编码支架变体的大型文 库。
[0059] 在一些实施方案中，编码支架和支架变体的分子可在各种表达系统中表达，并且 在一些实施方案中，可组合成融合系统的部分。编码支架和支架变体的DNA分子例如可与 可在几种不同细胞类型（例如293肥K或大肠杆菌）中表达的融合系统组合。293肥K细胞 的融合物例如可包括但不限于I巧前导序列和/或分泌的融合蛋白，如隧铁蛋白、脂质运载 蛋白2和人血清白蛋白。
[0060] 在一些实施方案中，本文所述的肤（例如打结肤）可表达为与脂质运载蛋白的融 合物。一方面，本发明包括一种产生肤的方法，其可包括在细胞中表达包括肤（例如打结 肤）和脂质运载蛋白的融合蛋白。所述方法可还包括从所述脂质运载蛋白分离所述肤，从 而产生肤（例如打结肤）。本发明还包括融合蛋白组合物，其包括脂质运载蛋白和肤（例 如打结肤）。运种融合系统为产生肤（例如打结肤）提供多种优于传统融合系统的优势。 作为背景并且不W任何方式进行限制，脂质运载蛋白为一类可具有保守折叠的蛋白质，所 述保守折叠的特征在于具有侧接a螺旋的八股P筒。脂质运载蛋白（如Lcn2、NGAL和 隧铁蛋白）在哺乳动物细胞中的表达水平等于或超过许多其它融合系统，包括Fc融合物。 本发明设及产生融合蛋白的方法，所述方法包括在细胞中表达融合蛋白，所述融合蛋白包 含肤或蛋白质结构域和脂质运载蛋白，从而产生所述融合蛋白。在一些实施方案中，所述 方法还包括从脂质运载蛋白分离肤或蛋白质结构域，从而产生肤或蛋白质结构域。在某些 实施方案中，肤或蛋白质结构域是抗体片段。在某些实施方案中，所述抗体是曲妥珠单抗 (trastuzum油）、英利昔单抗（inflixim油）、阿达木单抗（adalimum油）、0KT3或Fc。
[0061] 在一些实施方案中，肤或蛋白质结构域是人血红素加氧酶1或鼠血红素加氧酶1。 在一些实施方案中，融合蛋白还包含裂解位点。在某些实施方案中，所述裂解位点是弗林蛋 白酶裂解位点、膜蛋白酶裂解位点或TEV裂解位点。在一些实施方案中，从脂质运载蛋白分 离肤或蛋白质结构域是由在融合蛋白中的裂解位点处裂解所引起。在某些实施方案中，从 脂质运载蛋白分离肤或蛋白质结构域是在从细胞分泌所述融合蛋白之后发生。在某些实施 方案中，细胞为哺乳动物细胞。
[0062] 本发明设及产生肤的方法，所述方法包括：在细胞中表达包含肤和脂质运载蛋白 的融合蛋白；W及从脂质运载蛋白分离肤，从而产生肤。在一些实施方案中，通过蛋白水解 或通过融合蛋白中弗林蛋白酶裂解位点的裂解W使所述肤在从细胞分泌时从脂质运载蛋 白裂解而使肤与脂质运载蛋白分离。在某些实施方案中，细胞为哺乳动物细胞。在一些实 施方案中，肤W小于约200mg/l的浓度产生。
[0063] 在一些实施方案中，本发明设及组合物，其包含融合蛋白，所述融合蛋白包含肤和 脂质运载蛋白。在一些实施方案中，肤包含打结肤。在一些实施方案中，打结肤选自糜蛋白 酶抑制剂、黑竭毒素化e化toxin)、气泡蛋白、中期因子的C末端结构域、马铃馨簇肤酶抑制 剂和表皮调节素。在某些实施方案中，脂质运载蛋白是隧铁蛋白。在某些实施方案中，打结 肤包括至少两个二硫键。
[0064] 本文所述的肤（例如打结肤）可使用多种脂质运载蛋白来表达。如本文所用，术语 "脂质运载蛋白"是指如W下定义的蛋白质："St;ructureandsequencerelationshipsin thelipocalinsandrelatedproteins"，DarrenR.Flower，AnthonyC.T.North，Teresa K.Attwood，P;roteinScience(1993) 2 :5, 753-761。脂质运载蛋白可包括但不限于编号的脂 质运载蛋白（例如Lcn2(也称NGAL隧铁蛋白、24p3)等、鸡Ex-FABP和鹤譜Q86。
[0065] 在本公开的各个方面，将隧铁蛋白用作分泌伴侣。如本文所用，术语"隧铁蛋白" 是指能够结合小馨合剂的脂质运载蛋白。在一些方面，馨合剂可为天然的或经过工程化的。 在一些方面，隧铁蛋白结合于铁载体和=价铁载体络合物。例如，隧铁蛋白可为但不限于隧 铁蛋白或Ex-FABP。如本文所用，术语"隧铁蛋白"（作为专有名词）是指与人原型隧铁蛋 白相关的蛋白质的直系同源家族。
[0066] 当用作分泌伴侣时，隧铁蛋白有利地可用于分泌多种肤、蛋白质和蛋白质结构域， 包括细胞内肤、蛋白质和肤结构域。
[0067] 因为例如相对于较大蛋白质（成熟蛋白质是178个氨基酸并且分子量为 20547化)，隧铁蛋白尺寸小，所W隧铁蛋白适用作较大蛋白质的融合伴侣。而且，隧铁蛋 白中的C87S突变可防止二聚体化并且得到纯单体融合蛋白（参见Goetz,化H.等'The NeutrophilLipocalinNGALisaBacteriostaticAgentthatInterfereswith Siderophore-mediatedIronAcquisition'MolecularCell(2002) 10:1033-43)。隧铁蛋 白中存在的单个分子内二硫键会提高其稳定性。而且，隧铁蛋白仅具有单个N-连接糖基化 位点，所述位点设及在分泌之前邸中的正确处理。在一些方面，肤也可W与也会良好地用 作分泌伴侣的鼠SCN(也称作24p3) -起表达为融合肤。也可W使用其它同系物。另外，本 文提供的肤（例如打结肤）也可W与脂质运载蛋白家族的其它成员一起表达为融合系统， 所述其它成员包括Lcnl、Lcn6、Lcn8、Lcn9、LcnlO、Lcnl2、Lcnl5。在一些实施方案中，肤包 含二硫化物打结肤。在某些实施方案中，打结肤是PMP-D2、马铃馨簇肤酶、虎纹捕鸟蛛毒素 化uwentoxin)、欧前胡素（imperatoxin)、表皮调节素（epiregulin)、中期因子（mi化ine)、 气泡蛋白或芋螺毒素CVIC。在其它实施方案中，肤包含打结素。在一些实施方案中，脂质运 载蛋白包含隧铁蛋白。在一些实施方案中，脂质运载蛋白是隧铁蛋白。在某些实施方案中， 脂质运载蛋白是人隧铁蛋白、鼠隧铁蛋白、鸡Ex-FABP或鹤譜Q86。
[0068] 在一些实施方案中，可与内源裂解SCN-起（使RARYKR紧接在CIDG之后），和与 外源裂解的SCN-起（使ENLYFQ处于那个位置）来利用作为与SCN的融合物的肤（例如 打结肤）的表达。前者可在蛋白质输出（例如由弗林蛋白酶）期间由哺乳动物细胞裂解， 并且游离SCN和打结肤可分泌到周围培养基中。ENLYFQ是烟草蚀刻病毒（TEV)蛋白酶位 点，其未W内源方式见于哺乳动物细胞中。运个系统中的构建体可作为融合物分泌，从而允 许打结肤稍后通过添加外源性TEV蛋白酶而裂解掉。运可适用于回收打结素。在一些实施 方案中，可将纯化"手柄"（如聚组氨酸或聚精氨酸）添加到SCN，随后通过蛋白水解除去。 除打结肤W外，运些融合系统也可W用于医学关注的表达困难的蛋白质，如趋化因子、白细 胞介素和肤激素。
[0069] 在一些实施方案中，肤包含打结肤。在某些实施方案中，打结肤选白糜蛋白酶抑制 剂、黑竭毒素、气泡蛋白、中期因子的C末端结构域和表皮调节素。在一些实施方案中，脂质 运载蛋白包含隧铁蛋白。
[0070] 脂质运载蛋白融合物（例如隧铁蛋白和/或Lcn2与打结肤的融合物）可用几种不 同的方式使用。其可用W增大祀标蛋白质（例如潜在的治疗剂）的尺寸W增加其半衰期。 其可用W分泌祀标蛋白质，其中祀标蛋白质在细胞质中天然地表达。SCN还具有独特的配 体特异性并且紧密地结合儿茶酪型铁载体（细菌性铁馨合剂）。运使得可能将SCN融合物 与特异性配体（如化学治疗试剂或放射试剂或具有有利性质的某些类型或化合物）一起加 载。SCN当与铁载体和铁一起加载时具有深红色，其可有助于色谱或其它纯化步骤。
[007。 可用几种方式使用本公开的脂质运载蛋白融合物（例如SCN与册-1的融合物）。 例如，融合物可用W增大祀标蛋白质（例如潜在的治疗剂）的尺寸W增加其生物半衰期。 融合物可用W分泌祀标蛋白质，其中祀标蛋白质在细胞质中天然地表达。融合物也可W用 于将融合伴侣蛋白祀向特定位置W最大化治疗效果。SCN还具有独特的配体特异性、紧密 地结合儿茶酪型铁载体（细菌性铁馨合剂），并且具有肾保护作用。组合SCN与能产生协 同功能作用的其它肾保护剂（如册-1)。运还使得可能加载SCN融合物与特定配体，如放 射性金属原子（例如5申e或化）W允许体内追踪或特异性细胞毒性活性。除几种其它优 势W外，脂质运载蛋白融合系统还可用W在相对短的时间框架内制备大量蛋白质。在一些 实施方案中，肤的获得量可小于约lOmg/l、小于约20mg/L、小于约40mg/L、小于约50mg/L、 小于约lOOmg/l、小于约150mg/l、小于约180mg/L或小于约200mg/L。在一些实施方案中， 肤的获得量可在约lOmg/L和200mg/L之间、在约50mg/L和200mg/L之间、在约lOOmg/L和 200mg/L之间，W及在约150mg/L和200mg/L之间。在一些实施方案中，肤W小于约500mg/ 1、小于约400mg/l、小于约300m